阿苯达唑(albendazole, ABZ)是一种高效、低毒的咪唑衍生物类驱虫药，具有良好的药理活性[1],同时是世界卫生组织推荐的首选抗虫药[2]。由于ABZ极差的水溶性和较低的生物利用度[3],严重限制了其在临床中的应用。目前ABZ上市的剂型以片剂、混悬剂以及粉剂为主，然而其溶解性未能得到很好的解决，导致其生物利用度依旧较低[4]。因此，构建ABZ增溶、高效递送的药物体系对促进其临床应用具有重要意义。

自微乳给药系统(self microemulsion drug delivery system, SMEDDS)是由油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的均一、澄清和具有共向同性的热力学体系[5],其在体温条件下经搅拌或胃肠道的蠕动能够自发乳化形成透明或略带蓝色的微乳液，粒径大小为10～300 nm[6-8],是难溶性药物增溶及高效生物递送的良好载体[9]。因此，本研究利用SMEDDS作为药物递送载体，构建ABZ-SMEDDS,拟提高ABZ的溶解度、溶出度以及口服生物利用度，以期促进ABZ在临床中更好的应用。

1、材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

BSA124S-CW电子天平(德国Sartorius公司);KQ3200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHZ-88恒温振荡器(江苏金坛市中大仪器厂);UV-2600紫外分光光度计(日本岛津公司);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(常州金坛良友仪器有限公司);90 Plus PALS粒度分析仪(美国Brookhaven公司);3H24RI智能台式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);SpectraMax 190紫外酶标仪(深圳市科时达电子科技有限公司);TS2-S-SM倒置荧光显微镜(美国BioTek公司);Forma Series 3 WJ细胞培养箱(美国Thermo公司);HH-S数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)。

ABZ(江苏万高药业有限公司);甲醇、无水乙醇、浓盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、聚乙二醇400、肝素钠、乙酸乙酯、甲苯达唑、二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司);丁香油(上海阿达玛斯试剂有限公司);聚氧乙烯氢化蓖麻油RH 40(德国BASF公司);乙腈(美国TEDIA公司);RPMI 1640培养基、PBS(美国HyClone公司);噻唑蓝(美国Sigma-Aldrich公司);胰酶-EDTA消化液、4%多聚甲醛固定液、DAPI染色液(上海碧云天生物技术有限公司);胎牛血清(上海泰坦科技股份有限公司);香豆素6(C6,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 动物与细胞

10只雄性SD大鼠，SPF级，体重180～220 g, 由江苏大学动物中心提供(动物合格证编号：202337093)。结肠腺癌Caco-2细胞株购自浙江大学。

1.3 ABZ体内外样品分析方法的建立

使用紫外分光光度计对ABZ体外样品进行含量测定。称取ABZ标准品1 mg, 溶解于10 mL甲醇，得到浓度100 μg/mL的母液，再用甲醇将其稀释成50、40、30、20、10、5、2 μg/mL不同浓度，用紫外分光光度计测量其在295 nm处的光密度(D)值，以浓度为横坐标(X),D值为纵坐标(Y),拟合其标准曲线，并配制高(40 μg/mL)、中(10 μg/mL)、低(2 μg/mL)3个不同浓度，对其进行方法学验证。

使用高效液相色谱对ABZ体内样品进行含量测定。使用Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm),流动相乙腈-水48%∶52%(v/v),流速0.8 mL/min, 柱温30 ℃,进样体积20 μL。体内标准曲线的建立方法：在空白血浆中加入一系列浓度标准品溶液，使其血浆中ABZ的浓度相当于0.25、0.5、1、2、5、10 μg/mL,高效液相色谱检测药物浓度。以血浆中药物浓度为横坐标(X),药物峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)进行线性回归，绘制标准曲线方程。并配制高(5 μg/mL)、中(1 μg/mL)、低(0.5 μg/mL)3个不同浓度，对其进行方法学验证。

1.4 ABZ-SMEDDS的制备

以丁香油、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40以及聚乙二醇400分别作为处方的油相、乳化剂和助乳化剂。ABZ-SMEDDS的制备方法：称取一定量的丁香油、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40以及聚乙二醇400,水浴37 ℃条件下搅拌30 min, 得到空白SMEDDS,再称取一定量的ABZ加入空白自乳化微乳处方中，再次搅拌60 min, 得到ABZ-SMEDDS。

1.5 ABZ-SMEDDS的处方筛选

固定油相、乳化剂和助乳化剂的总质量为1 g, 称取不同比例的Km(乳化剂与助乳化剂的质量比分别为0∶10,1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,6∶4,7∶3,8∶2,9∶1)置于西林瓶中，同“1.4”项下的制备条件，缓慢加入双蒸水，根据表1判别各个比例的乳化等级，将能够形成Ⅰ、Ⅱ等级的处方作为能够形成微乳的处方，以油相的质量、Km以及水的用量作为伪三相图的顶点，绘制伪三相图[10],根据三相图中微乳的区域确定最佳的Km比例。

表1 五星级评判法则

1.6 ABZ-SMEDDS最佳处方的确定

固定Km,称取不同比例油相和Km,即不同比例的K(0∶10,1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5),根据表1,评判乳液形成的等级，确定处方的最佳比例。

1.7 ABZ-SMEDDS最佳处方的质量表征

1.7.1 外观评价

将新鲜制备的ABZ-SMEDDS置于西林瓶中，肉眼观察其性状。再称取1 g ABZ-SMEDDS,在温度为37 ℃,磁力搅拌的情况下，加入20 mL超纯水，用肉眼及激光笔照射观察其性状。

1.7.2 粒径分布与Zeta电位

称取适量的ABZ-SMEDDS,加入10 mL超纯水，涡旋超声，使其分散均匀，测定前使用0.45 μm滤膜过滤，通过90 Plus PALS粒径分析仪测定ABZ-SMEDDS的平均粒径、多分散指数与Zeta电位。

1.7.3 包封率与载药量的测定

按照最优处方组成制备空白的自乳化微乳，将空白自乳化微乳加入过量的ABZ,使用磁力搅拌器充分搅拌，使其达到药物饱和，将样品10 000 r/min离心30 min, 取微量上清液部分(W),使用色谱级甲醇将其稀释至一定倍数(V),滤膜过膜后使用紫外分光光度计测定其在295 nm处的D值，带入标准曲线计算药物浓度(C1),载药量的计算公式：载药量(mg/g)=(C1×V)/W。再取微量上清液，使用0.22 μm滤膜过滤，目的是除去游离药物，再加入甲醇将其稀释一定倍数，使用紫外分光光度计测定过膜后的药物浓度(C2),包封率量的计算公式：包封率(%)=(C2/C1)×100%。

1.7.4 微观形态观察

取少量的ABZ-SMEDDS置于离心管中，将其稀释至合适的检测浓度，将溶液滴加至铜网上，待其充分干燥后使用2%磷钨酸对其进行染色处理，红外灯下将样品充分干燥，置于透射电子显微镜下观察。

1.7.5 初步稳定性研究

将所制备的ABZ-SMEDDS分别于第1、3、7、15天测量其粒径、多分散指数、Zeta电位以及在295 nm处的D值，以此考察ABZ-SMEDDS的初步稳定性。

1.8 ABZ-SMEDDS体外溶出实验

使用溶出法对ABZ原料药及ABZ-SMEDDS进行体外释放行为学的考察。溶出介质为双蒸水、pH=1.2的HCl以及pH=6.8的PBS,释放介质的体积为180 mL,恒温(37±0.5)℃,转速100 r/min。具体步骤：分别称取ABZ原料药5 mg和含药5 mg的ABZ-SMEDDS装入硬质胶囊中，提前预热释放介质，待温度为37 ℃时，将样品投入装有释放介质的锥形瓶中，从样品进入介质开始计时，分别于5、15、30、45、60、90、120、180、240、360 min定时取样5 mL,再补加5 mL相应的空白介质。取出的样品用0.45 μm微孔滤膜过滤，通过高效液相色谱检测药物浓度，计算不同时间药物的累积溶出百分率。

1.9 ABZ-SMEDDS细胞毒性与细胞摄取实验

1.9.1 细胞培养

将Caco-2细胞按照3×105个/瓶的密度培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养，每隔1～2天换液，待细胞生长至整个培养瓶壁的80%以上时，即可进行传代操作。

1.9.2 细胞毒性实验

将细胞以每孔1×105个的密度种在96孔板中，培养24 h后，吸出培养基，每孔加入PBS清洗2～3次，然后在每孔中加入不同浓度的样品，包括原料药、空白自乳化微乳和ABZ-SMEDDS,每个浓度设置复孔4个，以RPMI 1640培养基培养的细胞作为对照组，以空白培养基(不加Caco-2细胞)作为空白组。给药完成后，再次培养24 h, 向每孔加入5 mg/mL噻唑蓝溶液20 μL,然后再次培养4 h, 将孔中内容物吸取干净，每孔加入二甲基亚砜150 μL,振荡10 min, 然后用紫外酶标仪检测其在490 nm处的D值。存活率的计算公式：细胞存活率(%)=(实验组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100%。

ABZ原料药各梯度浓度的配制：称取ABZ原料药1 mg, 加入100 μL二甲基亚砜，再加入4.9 mL RPMI 1640培养基，混匀，即得到200 μg/mL的ABZ母液，利用RPMI 1640培养基将其稀释成120、100、80、60、30、10 μg/mL备用。

空白自乳化微乳以及ABZ-SMEDDS各梯度浓度的配制：称取一定量的空白自乳化微乳以及ABZ-SMEDDS加入100 μL二甲基亚砜，再加入适量RPMI 1640培养基，混匀，配制成100 μg/mL的空白自乳化微乳以及ABZ-SMEDDS,利用RPMI 1640培养基将其稀释成1、0.8、0.5、0.3、0.1 μg/mL备用。

1.9.3 细胞摄取实验

C6是一种脂溶性的荧光染料，本研究使用C6代替ABZ制备C6-SMEDDS,以此考察ABZ在Caco-2细胞中的摄取能力[11-12]。取适量C6溶解至不含血清的RPMI 1640培养基中；取适量载C6的自乳化微乳制剂溶解至不含血清的RPMI 1640培养基溶液，保持两组中C6的含量相等。取对数生长期的Caco-2细胞，接种于共聚焦玻底培养皿，培养24 h后，弃去培养液，加入上述两组溶液，孵育1、2、4 h后，PBS清洗3次，然后用1 mL的4%多聚甲醛固定细胞15 min。接下来吸去多余的多聚甲醛，用PBS清洗3次。最后加入0.5 mL的DAPI染色液对细胞核进行染色，室温放置3～5 min, 用PBS洗去染色液，放置在荧光显微镜下观察。

1.10 ABZ-SMEDDS大鼠药代动力学实验

1.10.1 血浆样品处理方法

取血浆样品200 μL,置于1.5 mL离心管中，依次加入PBS 200 μL,甲苯达唑溶液(内标，1 μg/mL)250 μL,乙酸乙酯250 μL,涡旋混合振荡2 min后，12 000 r/min离心10 min, 取全部上清液至另一干净的离心管，所剩沉淀物中继续加入乙酸乙酯250 μL进行二次萃取，涡旋混合振荡2 min, 12 000 r/min离心10 min后，取上清液与前液合并，在70 ℃氮气水浴挥干，进样前用100 μL乙腈溶解，取20 μL进样检测分析。

1.10.2 动物实验方法

将SD大鼠随机分成两组，每组5只，大鼠灌胃前禁食12 h, 可自由饮水。实验开始时，将ABZ原料药使用羟甲基纤维素钠溶液混匀，ABZ-SMEDDS使用超纯水分散，按照70 mg/kg的剂量给大鼠灌胃，灌胃体积为3 mL,并于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24 h从眼眶静脉丛取适量血液，将其置于1.5 mL已提前注入20 μL肝素钠溶液的离心管中，3 700 r/min离心10 min, 得到血浆，血浆处理方法同“1.10.1”,高效液相色谱检测药物浓度，代入标准曲线计算血药浓度，绘制药时曲线并计算药动学参数。

1.11 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差

表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 方法学考察

ABZ体外样品分析方法建立的标准曲线：Y=0.046 3X+0.01(R2=0.999 9,2～50 μg/mL),线性关系良好，可以用于后续体外样品中药物浓度的计算。对体外样品分析方法进行方法学验证，结果显示，精密度方法学考察项下高、中、低3个样品浓度含量RSD分别为1.24%、0.11%和0.04%;回收率方法学考察项下高、中、低3个样品浓度的平均回收率分别为(100.51±1.32)%、(99.50±1.62)%和(99.77±2.56)%,RSD分别为1.14%、1.33%和1.95%;稳定性方法学考察项下高、中、低3个样品浓度含量RSD分别为0.05%、0.38%和0.33%。精密度、回收率以及稳定性的RSD值均小于2%,符合方法学的要求，成功构建ABZ体外样品的分析方法。

ABZ体内样品分析方法建立的标准曲线：Y=0.821 3X-0.090 1(R2=0.999 5,0.25～10 μg/mL),线性关系良好，药物的保留时间为6.0 min, 内标的保留时间为3.9 min, 峰形良好，互不干扰。对体内样品分析方法进行方法学验证，结果显示，精密度方法学考察项下高、中、低3个样品浓度含量RSD分别为1.31%、0.79%和0.99%;回收率方法学考察项下高、中、低3个样品浓度的平均回收率分别为(102.04±1.32)%、(100.21±1.62)%和(99.85±2.56)%,RSD分别为1.59%、1.63%和2.31%;稳定性方法学考察项下高、中、低3个样品浓度含量RSD分别为0.64%、0.81%和0.65%。精密度、回收率以及稳定性的RSD值均小于2%,符合方法学的要求，成功构建ABZ体内样品的分析方法。

2.2 乳化剂与助乳化剂比例的确定

处方筛选的结果如图1所示，当Km=8∶2时，利用Origin 8.0软件拟合出来的微乳区面积最大，故选择Km=8∶2作为处方中乳化剂与助乳化剂的最佳比例。

2.3 最佳处方的确定

实验结果如表2所示，随着油相在整个体系中比例的增加，乳化效果随之变差。但体系中更多油相的加入可使整个微乳充分分散，粒径更小，因此选择油相∶Km=2∶8作为最佳比例，故ABZ-SMEDDS最优处方如下：在1 g空白自乳化微乳处方中，油相为0.20 g, 乳化剂为0.64 g, 助乳化剂为0.16 g。

图1 不同比例乳化剂与助乳化剂的伪三相图

表2 油相与Km相容性五星级评判结果

2.4 ABZ-SMEDDS最佳处方的质量评价

2.4.1 外观评价

由图2可知，所制备的ABZ-SMEDDS在室温状态下为澄清透明的黄色液体，无明显的分层现象。当用蒸馏水将其稀释并用激光笔照射后，可明显看见一束光路，溶液澄清透明，表明药物能够较好地溶解于体系中，丁达尔现象说明可能存在纳米粒子。

2.4.2 粒径分布与Zeta电位

经测量，ABZ-SMEDDS的粒径为(52.14±1.82)nm, 多分散指数为(0.084±0.006),Zeta电位为(-13.67±0.35)mV,表明所制备的ABZ-SMEDDS粒径较小，粒度分布均匀，稳定性较好。见图3。

图2 ABZ-SMEDDS的外观图

图3 ABZ-SMEDDS的粒径分布图

2.4.3 包封率与载药量

经过计算，所制备的ABZ-SMEDDS的载药量为(36.60±1.20)mg/g, 包封率为(98.12±2.20)%。由此表明大部分的药物都包覆于制剂中，成功构建ABZ-SMEDDS。

2.4.4 微观形态

由图4可知，ABZ-SMEDDS外观呈圆球形，且均匀分布，相互之间无粘连，粒径大小与上述粒径仪测定结果相似。

图4 ABZ-SMEDDS的透射电镜图(×30 000)

2.4.5 初步稳定性

由表3可知，ABZ-SMEDDS的粒径、多分散指数、Zeta电位以及D值在15 d内无明显变化，且无分层现象，说明所制备的ABZ-SMEDDS稳定性良好。

表3 ABZ-SMEDDS稳定性研究

2.5 ABZ-SMEDDS体外溶出实验

根据图5可知，与ABZ相比，ABZ-SMEDDS在各释放介质的累积释放率都显著提高，且在30 min内均释放到100%,达到过饱和状态，说明该药物递送体系提高了药物的累积释放率。但累积释放率在释放后期均出现不同程度的下降趋势，可能原因是此时该体系处于热力学不稳定的状态。

图5 ABZ-SMEDDS在不同释放介质中的溶出曲线

2.6 ABZ-SMEDDS细胞毒性与细胞摄取实验

细胞毒性实验结果如图6所示，各组细胞的存活率都随药物浓度的增加而降低。其中，ABZ原料药<80 μg/mL、空白自乳化微乳处方<0.3 μg/mL、ABZ-SMEDDS<0.3 μg/mL时，细胞存活率>75%,该浓度范围不会对细胞增殖产生影响。

细胞摄取实验结果由图7所示，其中绿色荧光为C6发出，蓝色荧光是细胞核经DAPI染色后发出。在1 h和2 h, Caco-2细胞对原料药组的摄取比较有限，荧光显微镜下只能观察到微弱的荧光，直到4 h, 其荧光强度才可见。但与原料药组(C6)相比，制剂组(C6-SMEDDS)在1 h就出现了较为明显的荧光，到了4 h可见较强的荧光，说明大部分的药物能够通过细胞膜，从而实现吸收和利用，上述结果证明构建的自乳化微乳药物递送体系可明显提高Caco-2细胞对药物的摄取能力。

2.7 ABZ-SMEDDS大鼠药代动力学实验

由图8及表4可知，原料药和ABZ-SMEDDS分别在实验开始后的4 h和2 h达到血药浓度峰值，最大血药浓度(Cmax)分别为(486.61±18.81)ng/mL和(541.45±8.09)ng/mL,说明ABZ-SMEDDS具有一定的速释效果，且能够提高药物在体内的吸收峰值。与原料药相比，ABZ-SMEDDS的平均滞留时间(MRT)增加至(10.12±0.83)h, 相对生物利用度(F)提高至151.95%。因此，ABZ-SMEDDS能够显著提高药物在大鼠体内的生物利用。

图6 ABZ和ABZ-SMEDDS的MTT实验结果图

图7 荧光显微镜观察C6和C6-SMEDDS的细胞摄取情况(×200)

图8 ABZ和ABZ-SMEDDS经大鼠口服给药后的药时曲线图

表4 原料药及ABZ-SMEDDS药动学参数

3、讨论

ABZ作为生物药剂学分类系统Ⅱ类药物，具有低溶、高渗、生物利用度低等特点。本实验通过自乳化微乳体系的构建，显著提高了ABZ的溶解度和生物利用度。其主要原因有以下几点：第一，处方中选用的油相能够提高药物的溶解度，促进乳化，降低对胃肠道的刺激，增加药物的转运与吸收；第二，选用的助乳化剂聚乙二醇400能够促进药物溶解，调节乳化剂体系的亲水亲油平衡值，使构建的自乳化微乳体系具有更好的稳定性；第三，自乳化微乳体系在给药后能自发形成粒径小、稳定性好的纳米粒子，油相和水相的存在不仅有利于药物的释放，也有利于其胃肠道跨膜吸收。

国内外学者尝试采用自乳化体系提高ABZ溶解度，但其载药量普遍在10 mg/g以下[13-14],而较低的载药量在临床应用时易产生给药量过大等问题。本研究通过选择合适的自乳化微乳组分，显著提高了ABZ在自乳化微乳体系中的载药量。高载药量ABZ-SMEDDS的成功构建主要基于两点：其一，较好的组分相容性。在前期研究中发现，ABZ在玫瑰草油中溶解度最大但与其他组分的相容性一般，因此优化后的制剂体系载药量过低，后续选择了溶解度次之但相容性更好的丁香油作为体系的油相，显著提高了制剂的载药量。其二，高效乳化剂的选用。选用的乳化剂聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)是一种非离子型增溶剂与乳化剂，具有很好的乳化能力，其昙点为46 ℃,制备温度为37 ℃,避免在制剂制备过程中乳化剂的降解和析出对乳剂成型的影响[15],最大程度发挥了RH40的乳化能力，因此制得的ABZ-SMEDDS粒径小、分布均匀且稳定性好。

本研究制备的ABZ-SMEDDS能够较好地提高难溶性药物的溶出度和口服生物利用度，可为其他具有低溶解度和低载药量的难溶性药物纳米递送体系研究提供借鉴。

参考文献:

[1]谢英花,张冬梅,韩钰,等.基于增溶作用的阿苯达唑分散片研究[J].河北科技大学学报,2021,42(6):619-626.

[2]高惠静,陈蓓,张海波,等.阿苯达唑纳米脂质体冻干粉在大鼠体内药动学及肝靶向研究[J].中国医院药学杂志,2017,37(8):702-706.

[3]崔紫烟,冶赓博,于文昊,等.阿苯达唑治疗多房棘球蚴病研究进展[J].中国血吸虫病防治杂志,2023,35(1):104-110.

[4]田凯,许丹,卢迪,等.阿苯达唑纳米混悬剂的研制及其评价[J].中国兽药杂志,2022,56(7):60-67.

[10]韩英杰,杨继威,李凌娜,等.迷迭香酸自微乳的制备及口服生物利用度[J].烟台大学学报(自然科学与工程版),2023,36(2):164-170.

[14]张永军,王科燕,樊莲莲,等.阿苯达唑自微乳的研制及稳定性分析[J].石河子大学学报(自然科学版),2009,27(1):65-69.

[15]高晨雨,奚建强,宋定中,等.泽泻醇G自微乳的研制及其大鼠体内药动学评价[J].中国医药工业杂志,2021,52(7):912-919.

基金资助:镇江“金山英才”高层次领军人才培养计划(第六期“169工程”)培养对象科研项目; 句容市社会发展科技计划项目(ZA42109);

文章来源:盛新春,王海桥,朱源,等.阿苯达唑自微乳给药系统的制备工艺研究及其体内外评价[J].江苏大学学报(医学版),2024,34(06):542-549.