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高效液相色谱法测定小儿豉翘清热颗粒中连翘苷含量的方法

2025-03-21 18 上传者：管理员

摘要：目的探讨高效液相色谱（HPLC）法测定小儿豉翘清热颗粒中连翘苷含量的方法。方法采用AgilentzorbaxSB-C18（4.6 mm×250 mm, 5μm）色谱柱，流动相以乙腈—水（22∶78）为基础，流速控制在1.0 ml/min,波长和柱温分别是277 nm, 35℃。结果连翘苷浓度的线性范围为0.009 699～0.485 0 mg/ml（r=0.999 7）。结论所建立的HPLC法可用于测定小儿豉翘清热颗粒中连翘苷的含量。

关键词：
中药成分
儿童风热感冒
小儿豉翘清热颗粒
连翘苷
高效液相色谱法
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小儿豉翘清热颗粒对儿童风热感冒治疗作用明显,其中富含许多中药成分,包括清热解毒､消痈散疖的连翘,解表､解毒､宣郁的淡豆豉,清利头目､疏肝解郁的薄荷,发表散风､透疹消疮的荆芥,泻火除烦､清热利湿的炒栀子等,不仅可疏风解表,还可清热导滞｡本研究检测中药连翘含量的测定方法参考2010版的《中国药典》及其他相关医学文献,选取的供试验样品是连翘苷,以此建立高效液相色谱(HPLC)法,本研究通过HPLC法控制小儿豉翘清热颗粒中连翘质量,为后续工作提供一定的理论基础和参考依据[1]｡

1、仪器与试药

1.1仪器2台不同型号的高效液相色谱仪,分别是岛津LC-10AD.VP和Angilent.1260,1台二极管阵列检测器,型号是岛津SPD-M20｡

1.2试剂主要使用的试剂有色谱纯的乙腈､甲醇(AR)､超纯水｡

1.3对照品选择连翘苷,由中国药品生物制品检定所提供｡试验样品分成3批小儿豉翘清热颗粒,批号分别是11111802､11111901､11111902,购买于江苏济川制药有限公司｡

2、方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液制备:准确称取连翘苷并溶解,配置成每毫升中含2mg连翘苷的溶液,作为备用液｡具体做法:在10ml量瓶中,将2mg连翘苷对照品加入适量80%甲醇,然后进行溶解､定容和摇匀,即可得到所需结果｡

2.1.2试验样品溶液制备:分析天平量取2g试验样品,研磨至粉状,将其倒入带有瓶塞的锥形瓶中,用量筒准确取25ml甲醇倒入装有粉末状试验样品的锥形瓶中,塞紧瓶塞,并称重,再将锥形瓶超声处理30min,取出冷却称重,如发现前后重量有缺失现象,则用甲醇补足至先前重量｡再充分摇匀锥形瓶内容物,进行过滤｡待过滤完后,再准确称取10ml滤液,使其蒸干,再加入5ml乙醇(浓度为70%)进行溶解,然后加置在中性氧化铝柱上,用80ml乙醇(浓度70%)洗脱,收集洗脱液,之后进行浓缩,若浓缩后有残渣剩余,需用甲醇(浓度50%)溶解残渣,残渣溶解后,再将其装入5ml容量瓶中进行稀释,最后摇匀瓶中内容物再进行过滤,滤液即为试验样品所需液体[2]｡

2.1.3阴性对照溶液制备:按照处方要求,精密称量不含连翘的小儿豉翘清热颗粒,按照上述制备方法制备阴性对照溶液｡

2.2色谱条件(1)色谱柱:AgilentzorbaxSB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;(2)流动相:流动相选择乙腈—水混合液,混合比例为22∶78;(3)流速:通常设置为1ml/min:(4)检测波长范围是277nm处;(5)柱温一般为35℃;(6)进样量通常情况下是10μl/次｡

2.3系统适用性测试在2.2色谱条件之下,对以下3种溶液进行分析:配置好的对照品溶液､试验样品溶液､阴性对照溶液,对连翘苷峰计算之后获得理论塔板数,值在3000以上[3]｡

2.4甲醇浓度考察精密称取供试品5份,每份1g,分别加浓度为20%､40%､60%､80%､100%的甲醇溶液20ml,精密称定,超声提取30min,用0.45μm微孔滤膜滤过,进样,测定峰面积并计算连翘苷含量｡结果分析表明,使用80%甲醇提取时,连翘苷含量最高｡为确保试验结果的准确性和可靠性,重复试验5次,取平均值,结果表明,连翘苷含量随着甲醇提取浓度的增加而增加,使用80%甲醇提取时,连翘苷的含量最高｡说明在试验条件下,使用80%甲醇提取可以最大化地提取连翘苷,从而提高分析和测定连翘苷含量的准确性和可靠性｡

2.5专属性考察各取10μl配置好的上述溶液,开始分析测定｡测定结果显示,对于色谱峰保留的时间,试验样品溶液同于对照品溶液,而在阴性对照溶液色谱图中,在其待测成分保留时间处未出现其他杂峰｡分析结果说明,该法专属性极好,见图1｡

图1小儿豉翘清热颗粒HPLC图

2.6精密度试验精密称取10μl对照品溶液进样,并如此进行6次重复后所得相对标准偏差(RSD%)为0.42%｡研究结果表明,仪器的精度和密度均很高[4]｡

2.7线性关系考察精密称取连翘苷,用适量甲醇溶解连翘苷,配制浓度为0.4850mg/ml的溶液,预先准备5､10､20､50､100ml容量瓶各1个,然后吸取上述配制好的溶液2ml分别置于不同刻度的容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,于每个容量瓶中各取混合液10μl,经高效液相色谱仪对混合液进行检测｡其中横坐标是连翘苷浓度,纵坐标是色谱峰面积,制作标准曲线,得到回归方程,Y=6897884.34X+31665.24,其中r=0.9997｡结果表明,0.009699~0.4850mg/ml是连翘苷浓度范围,说明连翘苷浓度与色谱峰面积之间线性关系较好[5-7]｡

2.8稳定性试验选取配置好的相同批号11111901的试验样品溶液,分别在不同时间下进行测定,其中检测时间设置为0h､2h､4h､8h､12h､18h､24h,经检测后,连翘苷峰面积RSD%=1.63%,n=7,该值反映经测定24h内的试验样品溶液趋于稳定状态[8]｡

2.9加样回收率试验选取批号为11111901且已知含量的样品内容物,精细研磨,准确称量1g研磨粉于锥形瓶中,再在锥形瓶中加入1ml连翘苷对照品溶液,待溶剂挥发干后,根据上述2.1.2所提到的方法配制试验样品溶液｡测定时需要确保色谱条件一致,计算结果表明,连翘苷回收率高达98.29%,RSD%=0.82%(n=6)｡综上所述,通过HPLC法测定中药含量其准确性较高｡

3、讨论

小儿豉翘清热颗粒是在中医基础理论指导下,由连翘､淡豆豉､薄荷､荆芥､栀子(炒)､青蒿､槟榔､赤芍､黄芩､厚朴､大黄､柴胡､半夏､甘草14味中药饮片加工制备而成的颗粒剂,其味甘､微苦,具有疏风解表､清热导滞的功效,临床主要用于治疗小儿风热感冒挟滞证,如发热咳嗽､咽红肿痛､鼻塞流涕､纳呆口渴等症状｡小儿豉翘清热颗粒处方成分复杂,而2020年版《中华人民共和国药典》仅定量了该制剂中栀子苷和连翘苷的含量,并不足以客观､全面地评价产品质量,反映出中药发挥疗效是多组分､多靶点协同作用的固有特性｡因此,建立一种多指标定量评价小儿豉翘清热颗粒质量的方法十分必要｡

处方中的君药连翘被称为“疮家圣药”,具有清热解毒､消肿散结､疏散风热的功效,主治风热感冒､温病初起等,其主要成分包括苯乙醇苷类､木脂素类､黄酮类､萜类和挥发油等｡苯乙醇苷类成分(如连翘酯苷A)和木脂素类成分(如连翘苷)具有抗菌､抗病毒､抗炎､解热和中和内毒素等药理作用,与栀子或黄芩配伍,能够泻肺火导滞｡栀子中的环烯醚萜苷类(如栀子苷)是活性最高的物质之一,可以促进人体胆汁分泌,提高肝脏解毒能力｡黄芩在《神农本草经》中被列为中品,味苦､性寒,具有清热燥湿､泻火解毒等功效,其主要活性成分包括黄酮类,如黄芩素､汉黄芩素､黄芩苷､汉黄芩苷等,具有抗菌､抗炎､镇痛和抗氧化等药理作用｡赤芍性微寒､味苦,其主要活性成分包括萜类化合物,如芍药苷等,具有抗炎､抑菌和抗肿瘤等药理作用｡目前对小儿豉翘清热颗粒中所含的多种有效成分含量同时测定及其质量评价的研究报道较少｡因此,利用HPLC分析法对药品进行综合评价,为小儿豉翘清热颗粒质量的全面控制提供科学依据,具有重要的临床意义｡

3.1HPLC法特点理论上,HPLC法与气相色谱通用;技术上,HPLC法的色谱柱是采用极细小粒径的填充料通过特殊处理填充完成的,如此色谱柱的分离效果优于经典的液相色谱｡色谱柱后方连有高灵敏度的检测器,能够准确检测流出物,经总结,HPLC法的特点有:(1)高压:液相色谱法顾名思义其流动相是液体,载液经过色谱柱时常会受到阻滞,为了加快载液通过色谱柱的速度,就需要对液体施高压(150~350)×105Pa｡(2)高速:HPLC法流动相在柱内的流速与经典色谱法流动相相比,前者流速更快,通常流速为每分钟1~10ml｡在分析时间上,HPLC法分析时间≤1h｡(3)高效:HPLC法分离效率较普通液相色谱要高很多,主要是由于随着科技的发展,一些新型固定相更加提高了其分离效率｡(4)高灵敏度:HPLC分析具有极高的灵敏度,究其原因为HPLC连接的检测器本身灵敏度非常高｡此外,使用HPLC分析时取样量非常少,常以微升计｡(5)适应范围宽:HPLC法较气相色谱的适应范围宽,且气相色谱有局限性,就是气相色谱法不能有效分析一些高沸点和稳定性差的物质,而HPLC法则几乎不受局限[9]｡

3.2HPLC分析流程溶剂借助泵导入色谱系统中,输出后经过流量和压力检测后进入进样器｡检测物随流动相经过色谱柱分离后再进入检测器,最后采集检测信号,处理数据,并将色谱图记录下来｡

3.3HPLC分离过程HPLC的分离过程是溶质在固液相间进行交换的过程,相比于经典色谱分离过程,之所以可以有效分离物质主要是凭借着溶质在两相间不同的分配系数､不同的亲和力､不同的吸附力,以及不同大小的分子引起的排阻作用,最终分离物质｡最初,将试验样品置于色谱柱头上,加入样品,其中样品含有A､B和C3种不同组分,随后样品在流动相伴随下流入色谱柱,然后开始在固液相之间分配｡A组分具有较小的分配系数,则固定相很难固定A组分,所以最早也是极易随着流动相流出色谱柱｡而组分C具有较大的分配系数,固定相非常容易固定C组分,因此最晚流出色谱柱｡组分B则是在组分A､C中间,是第2个流出色谱柱的组分｡因此混合组分均是根据其组分在固液相中分配系数不同而最终实现分离的｡

3.4检测波长的选择在190~400nm处,通过UV扫描连翘苷对照品溶液和试验样品溶液,结果表明,连翘苷的最大吸收峰是在277nm处,也就是说277nm是连翘苷检测的波长范围｡

3.5考察提取方法该制剂是一种中药复合制剂,成分复杂多样,本试验所用的前处理措施是中性氧化铝柱洗脱法,该法可清除干扰成分,同时主要成分连翘苷不会有损失,本试验使用了2种超声方法,即直接超声法和浸渍过夜后超声;15min､30min､45min､60min不同的超声时间;1g､2g､3g不同的氧化铝柱中氧化铝用量;60ml､80ml､100ml不同洗脱溶剂用量｡确定了最终的提取方法:精密称取2g样品,研磨至粉状装入带有瓶塞的锥形瓶中,吸取25ml甲醇移入锥形瓶中,盖紧瓶塞充分摇匀并称重记录,经过超声处理30min,取出放置冷却后继续称重,若发现前后2次出现重量缺失现象,则用甲醇补足｡充分摇匀进行滤过,再加入5ml乙醇(浓度为70%)进行溶解,然后加置在中性氧化铝柱上,用80ml的70%乙醇洗脱,收集洗脱液,同时对洗脱液进行浓缩,若浓缩后有残渣剩余,需经甲醇(浓度50%)对残渣进行溶解,残渣溶解后,再将其移入容量瓶(5ml)中进行稀释,最后摇匀瓶内内容物再进行过滤,滤液即为所得样品[10]｡

3.6耐用性试验本研究对上述2种不同型号色谱仪和不同色谱柱的影响进行考察,均得到好的结果｡

3.7样品数据分析2020年版《中华人民共和国药典》规定,小儿豉翘清热颗粒规格为2g/袋,其中栀子苷不得少于6.4mg,连翘苷不得少于0.68mg｡本试验对15批小儿豉翘清热颗粒中的栀子苷和连翘苷含量进行测定,结果表明,所有样品中的栀子苷和连翘苷含量都符合药典要求｡然而,不同批次样品之间各成分含量存在差异｡测定结果显示,栀子苷含量范围为3.968~8.298mg/g,连翘苷含量范围为0.998~3.091mg/g,黄芩苷含量范围为3.805~7.019mg/g,汉黄芩苷含量范围为1.103~2.506mg/g,黄芩素含量范围为0.082~0.402mg/g,汉黄芩素含量范围为0.118~0.162mg/g,连翘酯苷A含量范围为1.053~4.088mg/g｡除汉黄芩素外,其余6种成分的含量差异较大,这可能与药材来源､炮制加工､生产操作或贮存条件等影响因素有关｡本研究对15批小儿豉翘清热颗粒进行了测定,综合评价排名前3的样品分别为S8､S6和S3,批号分别为20220612､20220602和20220513｡结果表明,收集的样品批次质量优于其他月份的样品｡

本试验同时建立了测定小儿豉翘清热颗粒中7种指标性成分的方法,这些方法具有很强的可操作性和高度的灵敏度｡为全面评估该复方制剂的质量,综合运用了HPLC分析法｡通过这种方法,不仅为小儿豉翘清热颗粒中各指标性成分的含量测定提供了新的思路,也为中药及中药复方制剂多指标成分的分析提供了一个可行的综合质量评价模式｡在试验过程中,采用不同的色谱柱和检测器,以优化分离效果和提高检测准确度,同时通过对试验条件的优化和对比,找出了最佳的试验方案,从而为后续试验打下了坚实的基础｡经过试验的反复验证和数据处理,得出了小儿豉翘清热颗粒中各成分的含量数据｡总之,本试验采用HPLC分析法对小儿豉翘清热颗粒中7种指标性成分进行全面评价,不仅为该药品的质量提供了重要的数据支持,也为中药及中药复方制剂多指标成分的分析提供了可行的综合质量评价模式｡这一结果为进一步研究该药品提供了重要的理论基础和实际应用价值｡

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文章来源:王晓倩,陈松.高效液相色谱法测定小儿豉翘清热颗粒中连翘苷含量的方法[J].临床合理用药,2025,18(08):153-155+159.