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用二维液相色谱法检测人血清中利福喷丁的浓度

2024-06-06 16 上传者：管理员

摘要：目的建立一种利福喷丁血药浓度检测的二维液相色谱法。方法用新型二维液相色谱仪检测利福喷丁的血药浓度，一维色谱柱：Aston SC2T(3.5 mm×50.0 mm, 5μm);二维色谱柱：Aston SCB(4.6 mm×250.0 mm, 5μm);柱温：40℃;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：335 nm;进样体积：300μL。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率，及稳定性。用该方法测定结核患者利福喷丁的血药浓度。结果利福喷丁在0.33～18.62μg·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=2.68×105x-5 850.36(r=0.997),回收率为99.81%～105.08%,日内、日间精密度均≤4.84%。结核患者利福喷丁血药浓度测定结果在0.10～54.70μg·mL-1,在治疗窗浓度范围(8～30μg·mL-1)内的占64.74%。结论该方法操作简便、灵敏度高、检测限低、专属性强，适用于临床血药浓度测定。结核患者服用利福喷丁的个体差异较大，个体化治疗时需要进行血药浓度监测。

关键词：
个体化用药
二维液相色谱
利福喷丁
治疗药物监测
肺结核
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结核病严重威胁人类的健康，世界卫生组织报告显示，2021年全球新发结核病例高达1 060万，其中有160万人死于结核病[1]。结核病的治疗主要依赖于针对结核分枝杆菌的长期联合化疗[2],常用的利福霉类药物有利福平(rifampicin, RIF)与利福喷丁(rifapentine, RFP),但人体对利福平容易产生耐药。临床上利福喷丁广泛用于替代利福平抗结核治疗。但是，有文献表明，利福喷丁的血药浓度个体差异较大，当药物过量时，肝毒性较明显[3]。利福喷丁的体内过程可能与基因、体质量、疾病种类等因素密切相关[4,5]。因此，对利福喷丁开展治疗药物监测具有一定的临床意义。本研究旨在建立一种能够满足临床利福喷丁血药浓度检测的二维液相色谱法，为后续血药浓度与临床疗效和药物不良反应的关系及体内外代谢等研究提供方法学支持。

一、材料和方法

1.药品与仪器

利福喷丁标准品，纯度：93%,批号：130541-200401,购自中国药品生物制品检定所。

LC-20A色谱部件，日本Shimadzu Corporation公司产品；FLC2701全自动二维液相色谱耦合仪，湖南德米特仪器有限公司产品。

2.受试者选择

本研究经深圳市第三人民医院科研伦理委员会批准(伦理批号：2022-019-02)。所有患者均签署知情同意书。76例结核受试者，平均年龄为20岁。

入选标准2023年1月至2023年10月深圳市第三人民医院门诊或病房治疗的结核患者，且连续服用利福喷丁7 d以上。

排除标准因患者原因无法获取血样。

3.治疗方法与血样采集

结核患者给药方案：利福喷丁0.15～0.60 mg qd或者0.9 mg biw,口服。采血时间为服用利福喷丁1～6 h后，取静脉血2 mL,置于EP管中，用乙腈去蛋白处理血样。当日测定血清中利福喷丁浓度。

4.测定方法

色谱条件第一维色谱柱：Aston SC2T(3.5 mm×50.0 mm, 5 μm);第二维色谱柱：Aston SCB(4.6 mm×250.0 mm, 5 μm);中间色谱柱：Aston二通；柱温：40 ℃;一维流动相：甲醇-乙腈-25 mmol·L-1醋酸铵盐水溶液，氨水调pH至7.00;第一维泵流速：0.8 mL·min-1;二维流动相：水(含1.0 mmol·L-1醋酸铵，乙酸调pH至3.00)-水(含1.0 mmol·L-1醋酸铵，氨水调pH至7.40)-乙腈-甲醇；第二维泵流速：1.0 mL·min-1;检测波长：335 nm; 进样体积：300 μL。

溶液和样品的配制标准溶液：称取利福喷丁对照品46.55 mg, 用甲醇溶解并定容至25 mL,配制成质量浓度为1 862 μg·mL-1的利福喷丁标准溶液。校准品中间液配制：取上述利福喷丁标准溶液，用纯甲醇分别配制成372.40、254.80、117.60、39.20、19.60、6.66 μg·mL-1。质控品中间液配制：取上述利福喷丁标准溶液，用纯甲醇分别配制成313.60、156.80、11.76 μg·mL-1。校准品的配制：用血清将上述校准品中间液分别稀释成18.62、12.74、5.88、1.96、0.98、0.33 μg·mL-1。质控品的配制：用血清将上述质控品中间液分别稀释成15.68、7.84、0.59 μg·mL-1。

血浆样品处理用蛋白沉淀法：吸取乙腈去蛋白剂1 000 μL至1.5 mL EP管中，再准确加入上层血浆400 μL,涡旋振荡1 min后，以1.45×105 r·min-1离心8 min, 取上层清液1 000 μL转移至进样瓶中混匀，待测。

5.方法学考察

专属性分别对空白血清(取10份空白血清混合得到)、利福喷丁标准溶液和患者服用利福喷丁后得到的血清样品按“血浆样品处理”项下方法操作后进行测定，观察在利福喷丁出峰位置有无干扰峰。

标准曲线与定量下限按“溶液和样品的配制”项下方法配制标准曲线溶液，每个质量浓度均设置3个平行样本，用外标法定量，以利福喷丁浓度为自变量，以利福喷丁峰面积为因变量，建立利福喷丁标准曲线。按“溶液和样品的配制”项下方法配制不同浓度的血清样品，以其信噪比为10∶1计算利福喷丁的浓度，即为定量下限。

精密度与回收率取配制好的利福喷丁低、中、高(0.59、7.84、15.683 μg·mL-1)3种质量浓度的质控样品，平行5份，按“血浆样品处理”项下方法操作，提取空白血清样品，将标准溶液加入空白样品提取液，得到相同浓度的样品，提取回收率=质控样品的峰面积/含药的基质峰面积×100%。取低、中、高(0.59、7.84、15.683 μg·mL-1)3种质量浓度的样品液各5份，按“血浆样品处理”项下方法操作，同日不同时间3种质量浓度分别测定5次，计算日内差，并每天分别检测低、中、高3种质量浓度1次，连续测定5 d, 计算日间差，考察方法精密度。

稳定性中质量浓度质控品反复冻融3 d, 每24 h解冻，考察样品反复融解的稳定性，中质量浓度质控品在2种温度下(常温、-20 ℃)实验，考察样品放置的稳定性。按“血浆样品处理”项下方法处理样品后进行测定。

二、结果

1.方法学评价

专属性空白血清、利福喷丁标准溶液和患者服用利福喷丁的血清样品的色谱图，如图1所示，利福喷丁出峰时间为9.91 min, 并且空白血清内源性基质均不干扰其测定，说明本方法专属性较好。

标准曲线与定量下限利福喷丁在0.33～18.62 μg·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=2.68×105x-5 850.36(r=0.997),最低定量限为0.05 μg·mL-1。

精密度与回收率建立的利福喷丁分析方法的回收率在99.81%～105.08%,日内标准偏差均小于3.23%,日间标准偏差均小于4.84%。该分析方法的灵敏度高，稳定性好，符合生物等效性研究的方法学要求。结果见表1。

图1 利福喷丁二维液相色谱仪色谱图

表1 用二维液相色谱法检测利福喷丁的精密度、准确度及提取回收率(n=5)

2.方法学应用

将建立的方法用于76例临床结核患者利福喷丁血药浓度测定，其中，儿童44例(57.89%)、青中年28例(36.84%)、老人4例(5.26%),共获得190个血药浓度数据，患者血药浓度在0.10～54.70 μg·mL-1。当利福喷丁质量浓度在8～30 μg·mL-1时，患者能在获得较好的疗效的同时尽量减少药物不良反应的发生。结果发现，在治疗窗质量浓度范围(8～30 μg·mL-1)内有123个，占64.74%。超过治疗窗浓度范围有67个，其中，血药浓度低于8 μg·mL-1的有55个，高于30 μg·mL-1的有12个。

三、讨论

目前，已有多种利福喷丁血药浓度检测方法的报道。彭明丽等[6]用甲醇去蛋白，欧阳韵倬等[7]用乙腈作为蛋白沉淀剂，柴健等[8]用不加入任何蛋白沉淀剂直接沉淀法，杂质去除效果不好，本研究在兼顾沉淀效率和样品稳定性后，前处理用乙腈沉淀、高速离心的方法去除蛋白。上述3种方法的检测限分别为0.60、0.31、0.25 μg·mL-1,存在检测限过高等缺点。本方法的最低定量限仅为0.05 μg·mL-1,能检测出较低浓度的样品，提高了检测方法的灵敏度，可以满足儿童利福喷丁血药浓度检测。本研究用外标法，实验结果的精密性、重现性好，符合生物样品的检测要求，简化了操作流程，便于临床利福喷丁血药浓度监测和药代动力学(pharmacokinetics, PK)研究的应用。

本研究将建立好的方法应用于临床利福喷丁治疗患者的血药浓度监测，结果发现，利福喷丁浓度波动范围(0.10～54.70 μg·mL-1)较大，在患者体内代谢过程存在较大的个体差异。这可能是由于不同年龄、体质量、肝肾状况和感染情况的患者具有不同的PK特征。重症患者存在分布容积(distribution volume, Vd)增加、蛋白结合改变、肾清除率增加等异常情况，其PK特征会不同于健康人群[9,10]。肥胖患者通常伴有其他疾病(如糖尿病、高胆固醇血症等),这些病理改变影响了抗生素的PK参数[11]。老年患者由于肝、肾清除率下降，因此半衰期延长，PK参数改变[12]。SAVIC等[13]评估了增加剂量对利福喷丁吸收和生物利用度的影响，结果表明，利福喷丁生物利用度随剂量的增加而降低。FRANCIS等[14]评估了芳基乙酰胺去乙酰化酶(arylacetamide deacetylase, AADAC)基因多态性对利福喷丁暴露的影响，结果显示，携带AADAC基因突变体的患者清除率降低10.4%。国内关于利福喷丁群体药代动力学的研究缺乏，本研究建立的方法学为基于群体药代动力学的个体化给药研究提供依据。此外，本研究比较了血药浓度超过30 μg·mL-1的7例患者服药前及服药一段时间后的肝功能指标发现，碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、总胆红素等指标均有不同程度升高。这表明当利福喷丁血药浓度超过30 μg·mL-1时，患者肝功能会受到一定影响，因此，临床有必要监测利福喷丁血药浓度，降低药物不良反应发生率。

本研究建立的血药浓度检测方法前处理操作简便，检测范围合理，可满足临床成人及儿童低浓度检测以及PK分析要求。本方法为后续群体药代动力学研究利福喷丁血药浓度与临床疗效和药物不良反应的关系提供了很好的方法学支撑。

参考文献:

[6]彭明丽,陈明,温筱煦,等.肺结核患者利福喷丁血药浓度监测研究[J].中国药物应用与监测,2018,15(2):81—84.

[7]欧阳韵倬,裴奇.HPLC法测定人血浆中利福喷丁浓度[J].海峡药学,2010,22(4):153—154.

[8]柴健,张洁,张立.RT-HPLC法同时测定血清中利福平和利福喷丁的血药浓度[J].天津药学,2012,24(1):20—21.

基金资助:深圳市科技计划基金资助项目(JCYJ20210324132012035);

文章来源:柯涛,何田,张培泽,等.用二维液相色谱法检测人血清中利福喷丁的浓度[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1638-1641.