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针灸对痴呆大鼠行为学、海马神经元凋亡蛋白的影响及机制

2024-07-10 20 上传者：管理员

摘要：目的研究针灸对血管性痴呆(VD)模型大鼠行为学及海马神经元凋亡蛋白的影响及机制。方法选取50只SD大鼠，从中随机取12只为正常组，剩余38只通过双侧颈总动脉缺血再灌注制作VD大鼠模型，成功36只，随机分为模型组、针灸组、阳性对照组各12只。针灸组定位穴位后针灸干预，阳性对照组尼莫地平灌胃，正常组与模型组不予处理，正常饲养。水迷宫实验对比大鼠平均逃避潜伏期；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定脑组织梗死体积；苏木素-伊红(HE)染色、尼氏染色观察海马CA1区病理形态；TUNEL染色观察海马CA1区神经细胞凋亡情况；Western印迹检测海马组织c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-JNK、胱天蛋白酶(Caspase)-8、Caspase-3蛋白表达。结果与正常组相比，模型组平均逃避潜伏期明显延长，脑组织梗死体积百分比、神经细胞凋亡指数明显增加(P<0.05);与模型组相比，针灸组和阳性对照组平均逃避潜伏期明显缩短，脑组织梗死体积百分比、神经细胞凋亡指数明显减小(P<0.05)。正常组CA1区细胞排列紧密有序，未见细胞形态改变；模型组神经元排列无规律，细胞核缩小，神经元结构松散，细胞形状不完整，细胞数量明显减少；针灸组和阳性对照组神经元排列较模型组更规则，神经元结构也更为完整。正常组海马区细胞整齐，形态完整，胞质内尼氏小体丰富；模型组染色较浅，神经元松散无序，细胞结构不完整，形状欠规则，神经元尼氏染色阳性细胞数明显较少；针灸组和阳性对照组较模型组神经细胞排列整齐，形态更为完整，胞质内尼氏小体更丰富。与正常组相比，模型组JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组相比，针灸组与阳性对照组JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论针灸可调节JNK相关蛋白表达，明显改善VD大鼠海马神经元凋亡及认知功能障碍。

关键词：
凋亡蛋白
海马神经元
血管性痴呆
行为学
针灸
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血管性痴呆(VD)是一种以认知能力下降为主要特征的慢性进行性痴呆，与急性或慢性脑血管病变密切相关[1]。VD患者临床常伴有认知功能障碍、神经功能障碍等，具体表现为计算能力、与人沟通能力下降，注意力不集中，步态不稳，大小便失禁，肢体控制能力下降等，这不仅影响VD患者的身心健康，也降低了生活质量[2]。流行病学调查发现，每年65岁以上人群的VD发病率约在3/1 000[3]。现阶段，VD的发病机制尚不明确，研究指出[4,5,6],其可能与神经细胞凋亡、神经坏死等密切相关。目前临床上并无VD的特效治疗方法，西医的治疗也仅以预防危险因素、改善临床症状为主[7]。近年来，中医治疗VD取得较大进展，逐渐受到人们的认可。研究表明[8,9],针灸可改善VD大鼠认知功能。因此，本研究分析针灸对VD大鼠海马神经元凋亡蛋白的影响并观察其行为学变化，探讨其可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康清洁级SD大鼠50只，雄性，6月龄，平均体质量(230±10)g, 许可证：SYXK(鲁)2017-0001,合格证：37009200009757。饲养于12 h光照/12 h 黑暗、温度(25±1)℃、相对湿度(50±10)%的动物房内，饲养期间自由摄食、饮水。实验前先适应性喂养7 d。从50只大鼠中随机取12只为正常组，剩余38只通过双侧颈总动脉缺血再灌注制作VD大鼠模型，成功36只，随机分为模型组、针灸组、阳性对照组各12只。

1.2 造模方法[10,11,12]

双侧颈总动脉缺血再灌注法造模，大鼠禁食不禁水24 h, 水合氯醛腹腔注射麻醉，颈部消毒，切口，分离单侧颈总动脉，阻断血流1 h后恢复血流10 min, 重复1次，2次缺血再灌注后4号手术线结扎颈总动脉近、远心端。生理盐水清洗伤口，缝合，注射青霉素。3 d后进行对侧颈总动脉缺血再灌注，操作同上。正常组仅于手术台固定，不进行操作。选择Zea Longa神经功能缺损评分5级4分制评分，1～3分的大鼠进行后续实验。

1.3 干预方法

针灸组：根据《大鼠穴位图谱的研制》[13]及《实验针灸学》[14]定位穴位。固定大鼠，用0.20 mm×13 mm一次性无菌针灸针，“命门”“大椎”直刺5 mm, “风府”向下斜刺5 mm, “百会”“神庭”向后平刺10 mm, “水沟”向鼻中隔方向斜刺2 mm, “内关”直刺5 mm, “大陵”“劳宫”直刺2 mm, 留针30 min。1次/d, 连续2 w。阳性对照组用尼莫地平灌胃(30 mg/片),灌胃剂量为2 mg/(kg·d),连续2 w。正常组与模型组常规饲养。

1.4 水迷宫实验

直径100 cm深40 cm的水池，平台直径8 cm, 高23 cm, 水温22～24 ℃,池中设置1个10 cm的平台，沉于水中2 cm。令大鼠从头朝池壁进入水中直至四肢立于平台上的时间为逃避潜伏期，4次/d, 限时120 s, 超过则计为120 s, 持续3 d, 计算平均逃避潜伏期。

1.5 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测脑梗体积

大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后解剖脑组织，制成2 mm的脑片，每个脑组织各5片。脑片置于2%TTC溶液染色，37 ℃温育0.5 h, 充分染色。于4%多聚甲醛固定2 h, 拍照，计算脑梗体积。

1.6 苏木素-伊红(HE)染色观察CA1区

大鼠麻醉处死后取海马，置于甲醛溶液，梯度乙醇对海马组织进行脱水，干燥箱烘烤，蜡溶解，进行干燥、脱蜡，进行HE染色，二甲苯透明、中性树胶封片，于镜下观察。

1.7 尼氏染色观察CA1区

大鼠脑组织于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成5 μm切片。二甲苯脱蜡，甲苯胺蓝液染色0.5 h, 清洗，冰醋酸液分化。风干后二甲苯透明，中性树胶封片，于镜下观察。

1.8 TUNEL染色观察CA1区神经细胞凋亡

对石蜡切片进行脱蜡和复水处理，吸收切片上的液体后，加入蛋白酶K工作液。37 ℃温育25 min, 脱色3次。从TUNEL试剂盒中选择末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)和脱氧尿嘧啶(dUTP),混合，滴在切片上，在37 ℃水浴中孵育2 h, 再经H2O2孵育2 h, 常温脱色。加入适量带抗巧光素抗体的辣根过氧化物酶(HRP),37 ℃培养箱30 min, 漂洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下控制显色时间，冲洗切片，后重染苏木素3 min, 冲洗，分化，反转蓝色和密封。采用Image Pro Plus6.0软件进行分析计算凋亡指数(AI)。AI=细胞凋亡总数÷总细胞数×100%。

1.9 Western印迹检测海马c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-JNK、胱天蛋白酶(Caspase)-8、Caspase-3蛋白表达

取脑后分离大鼠海马组织，液氮速冻后用冷TBS洗涤3次并剪碎，置于预冷匀浆器内，加放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，静待30 min, 离心15 min, 取上清，进行二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量。5×还原型上样缓冲液稀释混匀，沸水煮10 min, 凝胶电泳，将蛋白转运到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h, 加一抗稀释液JNK(1∶1 000)、p-JNK(1∶1 000)、Caspase-8(1∶500)和Caspase-3(1∶500)4 ℃过夜，二抗(1∶3 000)室温孵育1～2 h, 用电化学发光(ECL)检测条带采用融合FX5光谱成像。

1.10 统计学分析

采用SPSS21.0软件行方差分析及LSD-t检验。

2、结果

2.1 各组平均逃避潜伏期比较

与正常组相比，模型组平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05);与模型组相比，针灸组和阳性对照组平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05);针灸组和阳性对照组平均逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05),见图1、表1。

2.2 各组脑组织梗死体积百分比比较

与正常组相比，模型组脑组织梗死体积百分比明显增加(P<0.05);与模型组相比，针灸组和阳性对照组脑组织梗死体积百分比明显减小(P<0.05);针灸组和阳性对照组脑组织梗死体积百分比差异无统计学意义(P>0.05),见表1、图2。

图1 各组水迷宫轨迹

表1 各组平均逃避潜伏期、脑组织梗死体积百分比、海马CA1区神经细胞凋亡及JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达比较

图2 各组脑组织TTC染色

2.3 各组海马CA1区神经细胞凋亡比较

与正常组相比，模型组神经细胞凋亡指数明显增加(P<0.05);与模型组相比，针灸组与阳性对照组神经细胞凋亡指数明显减小(P<0.05);针灸组与阳性对照组神经细胞凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05),见表1、图3。

2.4 各组海马JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达

与正常组相比，模型组JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组相比，针灸组与阳性对照组JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达明显下降(P<0.05);针灸组与阳性对照组JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达明显差异无统计学意义(P>0.05),见表1、图4。

图3 各组海马CA1区神经细胞凋亡(TUNEL染色，×400)

图4 各组海马JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达

2.5 各组海马CA1区HE染色比较

正常组CA1区细胞排列紧密有序，未见细胞形态改变；模型组神经元排列无规律，细胞核缩小，神经元结构松散，细胞形状不完整，细胞数量明显减少；针灸组和阳性对照组神经元排列较模型组更规则，神经元结构也更为完整，见图5。

2.6 各组海马CA1区尼氏染色比较

正常组海马区细胞整齐，形态完整，胞质内尼氏小体丰富；模型组染色较浅，神经元松散无序，细胞结构不完整，形状欠规则，神经元尼氏染色阳性细胞数明显较少，针灸组和阳性对照组较模型组神经细胞排列整齐，形态更为完整，胞质内尼氏小体更丰富，见图6。

图5 各组海马CA1区组织(HE染色，×400)

图6 各组海马CA1区组织(尼氏染色，×400)

3、讨论

VD是因患者脑部血管病理改变引发脑部损害所造成的痴呆，其临床表现多为认知功能障碍及相关脑血管病神经功能障碍，临床特点为疾病发生迅速、阶梯式进展、呈现波动性或慢性病程，该病的发生发展与脑梗死、脑出血、脑静脉病变、白质病变、不完全缺血性损伤、局部和远处缺血性功能改变等相关。VD是常见痴呆类型之一，该病病程在5年左右，存活率较健康人群与阿尔茨海默病人群低。现阶段，我国VD的发病率较高且呈现增长趋势，另外，随着社会老龄化加重，心脑血管疾病的发病率也增加，因此引发的血管性认知功能障碍也日趋增加[15]。海马CA1区是学习、记忆的功能区，VD患者慢性脑区低灌注时，脑中活性氧逐渐积累，造成神经元破坏、中枢胆碱能功能障碍及神经元数量减少，引起海马CA1区功能障碍，进而出现学习、记忆等认知功能障碍[16]。中医讲到，VD属“痴呆”“呆病”。目前，临床大多数VD患者年龄较大，且多发生于脑血管发生病理改变后，由此分析，VD的发展部位在脑部，发病机制在于气、血、精、津液亏虚，血液运行迟缓，流通不畅，阻滞脑络。本研究采用针灸疗法，于命门、大椎、风府、百会、神庭、水沟、内关、大陵、劳宫穴施针，以此通经疏络、调节脑部气血运行、宁心安神[17]。

本研究提示，大鼠大脑学习、记忆功能区相关神经元受损，构建VD模型后，大鼠脑组织缺血缺氧，神经细胞受到损伤，神经元凋亡，因此造成大鼠学习、记忆、认知能力降低。经过针灸治疗干预后，大鼠学习、记忆能力改善，脑组织缺血、缺氧症状改善，海马CA1区损伤减轻，减轻了认知障碍。这可能是因为针灸提高了脑缺血部分的血流量，减少了海马CA1区神经细胞凋亡，改善神经细胞病理损害，这与林丽婷等[18]、Chen等[19]研究结果相一致。

研究表明[20],丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)分子信号通路密切参与了脑缺血再灌注损伤过程中的炎症和氧化应激，JNK是MAPK的亚族之一，能够参与细胞信号传递，细胞生长、发育、分化及凋亡等过程[21]。且研究表明[22],JNK通路参与痴呆的发生发展，并且抑制JNK通路及相关蛋白表达可减轻神经元凋亡情况，从而改善痴呆患者认知功能。Caspase家族可接受凋亡信号并进行传递，引起底物降解，完成凋亡执行。Caspase-8与Caspase-3分别处在Caspases级联反应的上、下游，参与细胞凋亡的发生发展[23]。本研究结果提示，缺血再灌注损伤引起JNK激活后磷酸化；JNK通路引起相关凋亡蛋白水平改变，参与凋亡过程，引起海马神经细胞凋亡，针灸可以调控海马细胞凋亡蛋白表达，抑制JNK通路，改善神经细胞凋亡。

综上，针灸可改善VD模型大鼠学习、记忆能力，减轻海马CA1区神经细胞的缺血损伤，这可能是通过调控JNK、p-JNK、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达，抑制了大鼠海马区神经细胞JNK通路介导的细胞凋亡来修复受损的神经元，从而改善中枢神经系统功能。针灸治疗VD的潜在临床应用价值高，但是否有其他机制参与尚不清晰，还需进一步研究。

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