胸部恶性肿瘤，其肺癌和食管癌的死亡率都长期处于我国肿瘤排行榜前十之内，且食管癌在我国有地域性高发现象。至今，临床上对于肺癌毛玻璃结节的精准诊断、食管癌病因学与淋巴结转移的生物学特征以及胸腺瘤和间皮瘤的病理诊断都存在盲点和难点。寻找可识别肿瘤的特异性指标能早期发现胸部肿瘤以提升手术根治性切除几率，或药物联合提高晚期患者的治疗反应率以达到改善预后，是推动胸部肿瘤临床诊治技术进步的有效手段和策略。噬菌体由蛋白质外壳和单一核酸构成，是自然界中广泛存在的可以感染细菌、真菌等微生物的一类病毒，因其独特的分子特征和功能被转化应用于微生物鉴定和抗原展示等分子生物学研究中。噬菌体展示技术( phage display technology，PDT)的发展最早受到Smith等实验启发，将限制性内切酶EcoＲI的编码基因插入丝状噬菌体外壳蛋白的基因Ⅲ中，能在外壳中表达出融合蛋白。随后，McCafferty和Winter等构建了表达肽段随机序列文库并导入丝状噬菌体内，其外壳表面能表达相应的肽段，并具有免疫原性［1］。基于噬菌体的生物学特征，PDT特异性将单一肽段/抗原展示到外壳表面，被应用到筛选细胞或组织的未知特异性结合肽段、制备靶向探针和寻找肿瘤新抗原靶点等领域中。为此，本文整理综述了PDT原理、分类及其应用在胸部肿瘤诊治中的实验经验，以期为未来胸部肿瘤诊断和治疗的临床前试验设计提供参考资料。

1、噬菌体展示技术原理与亚类

PDT的基本原理是在不影响噬菌体自身基因正常表达的情况下将外源性基因文库插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中，随机产生的肽段/抗原随外壳蛋白的表达展示到噬菌体表面，与细胞或抗原进行免疫杂交反应，筛选具有较强结合力的肽段。其筛选流程主要包括:噬菌体文库构建和扩增、吸附和免疫杂交结合、清洗过滤非特异性噬菌体、洗脱扩增高结合力噬菌体，经过上述三到五个筛选循环获得高亲和力、具有目的蛋白/肽段信息的特异性噬菌体［2］。PDT经多年发展，已形成多种亚类系统用于不同的研究目的。

1．1单链丝状噬菌体展示系统

单链丝状噬菌体展示系统基于丝状噬菌体的PⅢ和PⅧ衣壳蛋白，PⅢ是丝状噬菌体中分子量最大的衣壳蛋白，有两个位点可供外源序列插入，可以展示高亲和力的大片段融合蛋白; PⅧ的N端游离于噬菌体的表面，可以融合五肽等较小的肽链，常用于 ＜10个氨基酸多肽的展示。

1．2λ 噬菌体展示系统

λ 噬菌体主要由双链DNA和头部蛋白D与尾部蛋白Ⅴ组成，可以构建成D和Ⅴ两种展示系统。λ 噬菌体的装配在宿主细胞内进行，无需将融合蛋白分泌至宿主胞膜外，可以展示对宿主胞膜有毒性的多肽。

1．3 T4、T7噬菌体展示系统

T4噬菌体由双链DNA和外壳蛋白SOC、HOC等组成，可以在SOC位点的C端和HOC位点的N端实现两种外源性多肽的同时展示。T7噬菌体由双链DNA和衣壳蛋白10A与10B组成，一般在10B蛋白的C端进行外源性多肽展示，这样即使插入的序列含有终止密码子也能被完整展示。此外，T7噬菌体的培养周期短，在极端条件下仍能保持稳定的活性，适用面极广［3］。

2、噬菌体展示筛选肽在胸部肿瘤中的诊断与治疗

2．1特异性肽直接用于诊断与治疗

2．1．1诊断性肽

研究发现非小细胞肺癌特异性表达纤维蛋白原样蛋白1( fibrinogen like protein 1，FGL1) ;张婉婷等［4］通过构建纳米抗体噬菌体文库，筛选出FGL1特异性纳米抗体( NB2B9)，并设计了双纳米抗体ELISA检测方法，其可以快速、灵敏和低成本地检测血浆FGL1浓度用于临床肿瘤诊断。此外，Bakhshinejad等［5］、樊敏杰等［6］分别通过PDT筛选出非小细胞肺癌细胞系A549特异性结合肽( AWＲTHTP、SDWKLYTQPITL)，数据库BLAST中未有肺癌已知相关序列，且ELISA实验结果验证了其特异性。段红等［7］取食管癌患者癌周转移淋巴结构建食管癌相关人源单链抗体( single chain fragment variable，scFv)文库，筛选出食管癌细胞系Ecal09的特异性单链抗体，免疫组化结果证明其仅染食管癌组织。此外，有学者利用PDT筛选出不同恶性程度食管癌细胞系SHEEC、EC9706和Eca109的数个特异性肽，并通过ELISA、小鼠体内实验等证明了其特异性［8-9］。

2．1．2治疗性肽

有研究表明抗PD-1单抗发挥作用不依赖抗体Fc片段，且Fc片段会抑制药物疗效;范利华等［10］成功构建抗PD-1 VHH噬菌体展示文库，筛选出3种不含Fc片段的抗PD-1抗体( B7、H5、H12)，具有较好的转化应用价值。表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor，EGFＲ)在大多数非小细胞肺癌患者中过度表达; Lueacha等［11］ 通过PDT筛选出3种抗EGFＲ 结合肽(Ｒ9-VH18、Ｒ9-VHH35和 Ｒ9-VH36)，体外实验发现它们能抑制EGFＲ 酪氨酸激酶活性从而抑制人肺癌细胞系A549的迁移和增殖;李姝萍等［12］构建了肺癌相关单链抗体噬菌体文库，筛选出2个具有显著性EGFＲ 受体封闭功能的结合肽( BTHG17-1和BTHG17-2)。另外有研究表明EGFＲ 与其它家族受体异源二聚化会降低靶向药物的反应率;祝贺等［13］用参与二聚化的 β-环多肽作为抗原，筛选得到特异性纳米抗体( EGFＲdimer Nb77)，体外实验发现其能抑制人肺癌细胞系NCI-H292的增殖。此外，有研究发现70%的食管癌过度表达EGFＲ; Sayaka等［14］利用食管癌预后良好患者的外周血单核细胞mＲNA构建噬菌体文库，筛选出与EGFＲ 阳性食管鳞癌细胞特异性结合的单链多肽( KT112)。成纤维细胞生长因子受体1( fibroblast growth factor receptors1，FGFＲ1)在肺癌和食管癌中过度表达，且与患者生存呈负相关;谭乔燕等［15］通过PDT筛选出FGFＲ1抑制肽(Ｒ1-P2肽)，其通过抑制FGFＲ1及其下游EＲK1 /2信号从而抑制肿瘤增殖;另外Chudzian等［16］ 筛选出3种抗FGF1单链抗体( scFvA、scFvC和scFvD)作为新型FGF1抑制剂。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)激活VEGF受体2( VEGFＲ2)及其下游信号传导途径是启动和促进肿瘤血管生成的关键步骤;代功鹏等［17］构建了展示VEGFＲ2胞外结构域的T4重组噬菌体( T4-VEGFＲ2)，其可以降低肿瘤组织的微血管密度、抑制肿瘤生长并延长Lewis肺癌荷瘤鼠存活时间。转化生长因子 β( transforming growth factorβ，TGF-β)在肺癌中高表达，且与肿瘤恶性程度及预后密切相关;王玥等［18］通过PDT筛选出2种抗TGF-β1纳米抗体( B3、C8)，它们能特异性识别并中和TGF-β1，显著抑制肿瘤增殖。此外，有研究提示αv整合素调节TGF-β 的激活，并直接参与促肿瘤表型的转化;Gallo等［19］筛选并构建了针对 αv整合素两个不同表位的双特异性抗体( biIgG AV1b /2b)，体外实验发现其能显著抑制肺癌细胞系H596、H292、A549和H460的增殖和迁移。此外，在胸部肿瘤中，多位学者［20-22］通过PDT分别筛选出热休克蛋白70的特异性单链抗体( G6 scFv)、促生长转录因子E2F1的特异性抑制肽( HHHＲLSH)、血管细胞黏附分子VCAM1的人源性单克隆抗体( VCAM-1-D6)、糖蛋白hYKL-4的3种单克隆抗体( H1、H2和H4)、α-叶酸受体的靶向肽( 3A102 VH)、抗CD47的3种特异性纳米抗体( BL21-VHH-2B1、BL21-VHH2B5和BL21-VHH-2B13)、ITGdvβ6特异性结合肽( SFITGdvβ6 )和胸苷激酶1的人源性抗体( 4-H-TK1_A1和4-HTK1_D1)，为靶向新药开发提供了新素材。

2．2特异性肽间接用于诊断与治疗

2．2．1转化应用于药物偶联治疗

对于没有抗肿瘤活性的单克隆抗体/肽段，可以将其与药物偶联制作成抗体药物偶联物( antibody-drug conjugate，ADC)，以单克隆抗体为载体将药物靶向运送至肿瘤细胞。Sokolowska-Wedzina等［23］通过PDT筛选出抗FGFＲ1人源化单链抗体( scFvD2)，以其为载体将细胞毒性药物Monomethylauristatin E靶向运送至FGFＲ1阳性肺癌细胞中发挥效用。研 究 报 道 抑 制CD55可以诱导细胞凋亡，且CD55在76．47%非小细胞肺癌组织标本中过度表达; Dho等［24］ 通 过PDT筛选出抗CD55抗体并与放射性核素177Lu偶联形成177 Lu抗CD55抗体，在治疗胸膜转移性肺癌小鼠模型中，可以显著抑制肿瘤的生长并将小鼠中位存活率提高两倍。限制间皮瘤靶向药物开发的主要原因是缺乏间皮瘤细胞特异性表面抗原;间皮素是间皮瘤最常见的细胞表面抗原，然而它仅在上皮性间皮瘤中表达且正常间皮组织也会表达; An等［25］通过PDT筛选出两种能特异性识别间皮瘤所有亚型的scFv( M1和M25)，将它们构建成包裹拓扑替康的免疫脂质体后能特异性杀伤间皮瘤细胞;之后Su等［26］将M25特异性结合的表面抗原确定为ALPPL2( alkaline phosphatase，placental-like 2)，并设计了一种以ALPPL2为靶点的ADC，其在体外和体内对上皮性和肉瘤性间皮瘤都有显著抑制效果。

2．2．2转化应用于分子影像诊断

通过PDT筛选出的小分子多肽具有靶向性强、组织渗透性好、较短的血清半衰期、较高的生物降解性、易被肿瘤细胞摄取、易于修饰和增强成像剂体内稳定性以及生物活性等优点，为肿瘤诊断和术后监控提供应用价值。癌胚抗原( carcinoembryonic antigen，CEA)是非小细胞肺癌常见的生物标志物; WANG等［27］ 通过PDT筛选出CEA阳性H460细胞的特异性抗CEA纳米抗体，并用锝 －99m( 99m TC )和FITC标记，实验结果证明其作为CEA阳性非小细胞肺癌分子探针具有高度特异性。人表皮生长因子受体3 ( human epidermal growth factor receptor 3，HEＲ3)与肺癌靶向治疗的耐药性高度相关，检测HEＲ3的表达量可以指导临 床 用 药; Larimer等［28］ 筛选出特异性抗HEＲ3抗体( HEＲ3P1)，通过PET成像准确量化了HEＲ3的表达，证明这种新型HEＲ3成像肽可以无创检测HEＲ3水平。非典型增生腺瘤( atypical adenomatous hyperplasia，AAH)和鳞状细胞增生( squamous cell dysplasia，SCD)是肺腺癌和鳞癌的癌前病变，精确诊断AAH和SCD有助于早期诊断肺癌;刘薇等［29］构建了肿瘤相关蛋白噬菌体文库，筛选出AAH和SCD特异性结合蛋白并制成筛查芯片，其检测AAH的敏感性和特异性为82%和70%，检测SCD的敏感性和特异性为86%和78%。此外，多位学者通过PDT分别筛选出肺癌细胞的特异性结合肽( CＲQTKN肽、NSP1、HSP1、HSP2和HSP4)并制成分子探针，通过体内体外实验证明了它们用于肺癌分子成像的特异性［30-32］。Kang等［33］ 通 过PDT筛选出食管癌细胞特异性结合肽SNFYMPL)，用近红外荧光团Cy5．5标记制成SNF-Cy5．5探针，经体外和体内实验证明了其食管癌分子成像的特异性; Zhou等［34］筛选出FGFＲ2的特异性肽( SＲＲPASFＲTAＲE)，用Cy5．5标记制作成分子探针可应用于食管腺癌的早期诊断。

3、目前医学前沿中应用的几种组学筛选技术都有其各自的优缺点

SELEX技 术( systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)即指数富集的配体系统进化技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出与靶抗原特异性结合的核酸适体，该技术最大优点是靶点类型广泛，且核酸适体的低免疫原性和强穿透性拥有着天然优势，但核酸适体还有在体内应用时易被核酸酶降解等尚待解决的问题［35］;ＲNA干扰技术(ＲNA Interference，ＲNAi)通过体外合成的短链 ＲNA识别并降解mＲNA从而抑制基因翻译导致基因功能性缺失，可以抑制特定基因的表达，已被广泛用于探索基因功能、传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域，但 ＲNAi无法完全抑制基因表达和稳定性及药物递送性低等问题，导致目前进入临床应用的药物并不多［36］;CＲISPＲ-Cas9全基因组筛选技术能在全基因组范围内发现具有特定生物学功能的基因，该强大的工具已被广泛应用于基因编辑、基因功能研究、癌症免疫治疗和致癌病毒消除等诸多领域中，但其无法揭示细胞内更复杂的生物学调控网络，且需要进一步消除脱靶效应、提高基因组编辑及递送效率等以满足临床应用的需求［37］。PDT自被发明以来便进入快速发展阶段，克服了传统杂交瘤技术无法直接制备人源化抗体、制备单克隆抗体时间长、操作复杂和应用前景有限等缺点，并因其高通量、便捷灵活等特点被广泛应用于生命科学等研究领域。在胸部肿瘤诊治中，大量特异性肽通过PDT被发现并被制成探针或药物用于肿瘤筛查、诊断和靶向治疗等，但PDT在胸部肿瘤中仍多处于实验室研发阶段，在人体内的有效性、安全性以及结合机制需要进一步探索，且提升肽类分子透膜性和稳定性是走向临床应用的必要条件。此外，PDT在胸腺肿瘤和间皮瘤等疑难、罕见胸部肿瘤中尚缺乏研究，利用PDT发现特异性结合肽，可能能为其诊治方案提供有效新途径。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金面上资助项目(编号:82172567);

文章来源:姚其峰,赵安,毛伟敏.噬菌体展示筛选肽在胸部肿瘤诊断与治疗中的应用[J].实用癌症杂志,2025,40(03):519-522.