首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 影像检验论文 > 肿瘤诊断论文 > 结直肠癌患者早期的静脉血KRAS基因突变检测研究

结直肠癌患者早期的静脉血KRAS基因突变检测研究

2020-09-11 731 上传者：管理员

摘要：目的：检测早期结直肠癌患者的静脉血鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)突变情况。方法：将肠镜留取的患者结直肠癌组织标本进行病理学诊断，将病理学诊断为腺瘤伴高级别癌变的24例患者作为试验组，诊断为正常的12例患者纳入对照组。采用艾德-扩增阻滞突变系统(ARMS)检测标本的19种KRAS基因突变。结果：试验组24例腺瘤伴高级别癌变患者肿瘤发生部位和组织学类型比较，差异无统计学意义(P>0.05)。试验组24例静脉血和对照组12例静脉血标本中KRAS基因均未检出突变。结论：早期结直肠癌(和癌前)患者的血液中KRAS基因突变量较低，需要提高检测方法的灵敏度。

关键词：
KRAS基因突变
恶性肿瘤
早期诊断
结直肠癌
静脉血
加入收藏

根据2018年全球癌症统计、2015年中国癌症统计和2018年全球癌症在线数据库的资料，2018年中国新增癌症病例430万，死亡病例290万，36.4%死于消化道癌症[1]；致癌危险因素中，环境和生活方式占40%，吸烟占24.5%，慢性感染占17%[2]。中国结直肠癌的发病率和病死率均保持上升趋势，2015年中国癌症统计数据显示：我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万。城市地区远高于农村，结肠癌的发病率明显上升[2]。

直肠癌患者的鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）是否突变与肿瘤发病机制间具有较大的相关性，临床研究表明结直肠癌患者的KRAS基因突变率为30%～40%;KRAS基因突变出现在结直肠癌的早期，患者的原发灶与转移灶的KRAS基因突变情况基本一致[3]。将KRAS基因是否突变作为分子标志物对结直肠癌进行早期筛查，检测结果对结直肠癌的防治具有重要意义。

PCR技术使基因突变检测得到了较大的进展。本文采用基于扩增阻滞突变系统（ARMS）的荧光定量PCR技术检测KRAS基因突变，该方法具有简单、方便、快速和灵敏度较高等优点，易于临床开展。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取陆军军医大学第二附属医院2018年6月至2019年3月进行肠镜检查的患者为研究对象，诊断标准为结直肠镜检查+病理学诊断。将病理学诊断为腺瘤伴灶性高级别癌变的24例患者纳入试验组，将病理学诊断未见异常的12例患者纳入对照组。试验组男14例，女10例；年龄38～72岁；乙状结肠腺瘤伴灶性高级别癌变10例，升结肠腺瘤伴灶性高级别癌变6例，直肠腺瘤伴灶性高级别癌变8例；管状结肠腺瘤14例，绒毛状结肠腺瘤10例。对照组男6例，女6例；年龄42～68岁。试验组纳入标准为病理学诊断为腺瘤伴高级别癌变；排除标准为诊断为非结直肠癌的其他癌症或诊断为肠炎或肠息肉等良性病变。试验组与对照组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1两组一般资料比较[n(%)]

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试剂

核酸（循环DNA）提取试剂购自厦门艾德生物医药科技有限公司。BufferCDL、DigestSolution、DNATracer、BufferCDB、BufferCDD、BufferCW1（浓缩液）、BufferCW2（浓缩液）、BufferCDE、KRAS基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）均购自厦门艾德生物医药科技有限公司。KRAS19PCR反应条（引物、探针、镁离子、dNTPs),KRAS19混合酶（TaqDNA酶、UNG酶），KRAS19阳性对照（质粒DNA），阴性对照（纯化水）。KRAS19PCR反应条组成：KRAS19反应液1-11,KRAS19外控反应液。

1.2.2 仪器

StratageneMx3000P实时荧光定量PCR仪购自美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集和保存

患者做肠镜前，采集肘静脉约15.0mL(4支商品化的乙二胺四乙酸二钾抗凝采血管），缓慢轻柔颠倒采血管6～8次（防止静脉血凝集或溶血），3000r/min离心10min，在生物安全柜内收集上层血浆（约8.0mL），血浆未上机检测前于-80℃冰箱保存。

1.3.2 标本DNA提取

按核酸提取试剂（型号：循环DNA）说明书进行操作，DNA分离完毕后，使用Nanodrop2000测定DNA水平，DNA水平大于2ng/μL，吸光度A260/A280为1.8～2.0。DNA提取后6h内未上机检测应保存于-20℃以下。

1.3.3 PCR检测流程

PCR反应体系：DNA样品65.8μL,KRAS19混合酶4.2μL，每反应管加入混和好的PCR反应物5μL。KRAS19阳性对照（质粒DNA）和阴性对照（纯化水）按样品DNA的检测步骤操作，对PCR检测流程进行质量控制。后统一上机检测，第1阶段：95℃、5min；第2阶段：95℃25s,64℃20s,72℃20s，循环15次；第3阶段：93℃25s,60℃35s,72℃20s，循环31次。第3阶段60℃时收集FAM和HEX（或VIC）信号。

1.3.4 结果判断

确定扩增曲线的拐点位置，得到Ct值，根据Ct值把检测结果分为阴性（Ct值≥28）、弱阳性（26≤Ct值<28）和强阳性（Ct值<26）。

1.4 统计学处理

应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

KRAS基因19种突变检测结果，试验组（24例）和对照组（12例）的血浆KRAS基因的突变率都为0.00%。试验组患者的血浆KRAS基因19种突变检测结果见表2。

表2试验组患者血浆标本的KRAS基因19种突变检测结果

3、讨论

KRAS基因突变检测的常用方法包括Sanger法测序、实时荧光定量PCR技术、ARMS技术、高分辨率熔解曲线（HRM）技术等，检测对象主要为癌变组织。Sanger法测序是检测基因突变的金标准，丁莉等[4]对378例结直肠癌标本进行了检测，KRAS基因突变率为34.7%；代云等[5]对265例结直肠癌患者肿瘤组织标本进行了检测，KRAS基因突变率为32.1%；孙新超等[6]对210例结直肠癌患者肿瘤组织标本进行了检测，KRAS基因突变率为43.8%。实时荧光定量PCR技术应用最为广泛，凌云等[7]检测了304例结直肠癌石蜡包埋标本，KRAS基因突变率为38.82%；梁跃等[8]检测了58例结直肠癌组织标本，KRAS基因突变率为29.31%；贠田等[9]检测了389例结直肠癌组织，KRAS突变率为42.4%。毛旭华等[10]采用HRM技术检测了60例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本，KRAS基因突变率为36.67%(Sanger法的突变率结果为33.33%);MIRANDA等[11]采用HRM-定量PCR方法检测了47例结直肠癌组织KRAS基因的2号外显子突变情况，灵敏度和特异度分别为83.30%和96.6%，与第二代测序（NGS）法结果高度一致。

本文采用的方法基于ARMS，其原理为PCR引物的3′端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增。这一方法需先设计等位基因的特异性PCR扩增引物，只有引物3′碱基与模板严格配对才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。罗妙玲等[12]检测了177例结直肠癌手术切除或穿刺活检标本，KRAS基因突变率为37.9%；祝继原等[13]检测了144例结直肠癌患者的手术石蜡标本，KRAS基因突变率为43.06%；张莹等[14]检测了60例结直肠癌患者手术切除组织，KRAS基因突变率为38.3%。

本文检测了血液标本中KRAS基因的突变情况，相关文献较少。李学琴[15]采用酶切富集-PCR联合焦磷酸测序技术检测43例晚期非小细胞肺癌患者癌组织和外周血，癌组织KRAS突变率为9.30%，静脉血KRAS突变率为6.95%。崔发强等[16]采用PCR法检测96例原发性肝癌患者外周血，KRAS突变率为9.9%。伍洁[17]采用PCR-DNA直接测序法检测129例原发结直肠癌组织标本和静脉血标本，癌组织KRAS突变率为39.53%，静脉血KRAS突变率为32.56%。BOTEZATU等[18]采用富集突变PCR-定量DNA熔解曲线分析（mePCR-qDMA）技术检测20例结直肠癌患者的肿瘤组织和血浆KRAS基因2号外显子12和13位密码子突变情况，KRAS基因突变率不一致（组织为60%、血浆为25%）。

ARMS技术尚未大规模应用于血浆标本的检测，本研究尝试检测血浆中KRAS基因突变的情况，但结果未检测出KRAS基因突变，可能原因有：（1）检测标本例数较少；（2）结直肠癌早期（包括癌前）血液中的KRAS突变基因含量较少；（3）检测方法的灵敏度不足以检测到微量KRAS基因突变。

4、结论

静脉血是结直肠癌早期筛查的理想标本，但需要提升检测方法的灵敏度；采取不同方法的联合达到扬长避短的目的，极大提高检测的灵敏度。

参考文献：

[2]孙燕,顾晋,汪建平.中国结直肠癌诊疗规范(2017年版)[J].上海医学,2018,41(8):449-463.

[3]范志军.KRAS基因突变与结直肠癌的研究进展[J].中外医学研究,2017,15(8):163-164.

[4]丁莉,韩义明,郑杰,等.结直肠癌中KRAS基因突变及意义[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(10):1156-1159.

[5]代云,郑国华,李青.结直肠癌患者BRAF､KRAS､NRAS和PIK3CA基因突变与其病理特征的关系[J].临床与病理杂志,2017,37(5):875-880.

[6]孙新超,秦旭,王金海,等.结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS､NRAS､BRAF基因突变状态分析[J].社区医学杂志,2017,15(11):8-11.

[7]凌云,胡海燕,邱田,等.结直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变检测及其临床意义[J].中国肿瘤临床与康复,2016,23(6):645-649.

[8]梁跃,李光学,马庆庆.结直肠癌KRAS､NRAS､PIK3CA､BRAF基因联合突变分析及临床意义[J].中国社区医师,2018,34(14):107-109.

[9]贠田,王长松,李富林,等.结直肠癌患者KRAS､NRAS､BRAF基因突变与临床病理特征关系的研究[J].实用医药杂志,2019,36(8):733-736.