骨关节炎是一种以关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为特征的常见慢性关节疾病，在60岁以上的老人中致残率超过20%,临床主要表现为膝关节疼痛、肿胀及功能受限[1-3],中医属于“骨痹”范畴，临床治疗常用熏洗之法，用药频次分析显示透骨草居于前列[4-5]。

透骨草品种众多，凤仙透骨草为其主流品种。凤仙透骨草来源于凤仙花科植物凤仙花Impatiens balsuminaL.的茎，具有祛风散寒、温经通络、活血止痛之效，主要含有的黄酮类、萜类、萘醌类等化学成分，具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化等作用[6],但目前该药治疗骨关节炎的药效物质基础鲜有报道，使其提取工艺缺乏指导。

本研究采用网络药理学及分子对接技术，结合LC-MS筛选并预测凤仙透骨草治疗骨关节炎的主要有效成分、潜在作用靶点和信号通路；采用单因素试验和响应面法对凤仙透骨草提取工艺中的乙醇浓度、料液比、回流提取时间3个因素进行研究，以活性成分的含量为评价指标，借助层次分析法(AHP)-指标相关性的指标权重确定方法(CRITIC)混合加权法进行权重分配，Box-Behnken响应面法优化凤仙透骨草的提取工艺。

1、仪器与试药

1.1仪器

Agilent Technology 6545 LC/Q-TOF超高效液相色谱串联质谱仪，Agilent公司；Ultimate 3000高效液相色谱仪，Thermo Fisher公司；KH7200B超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；CPA225D十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；HB 10 SO96旋转蒸发仪，IKA集团；L400离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SL-100移液器，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2试药

凤仙透骨草，购买于成都荷花池中药市场，经成都医学院游元元教授鉴定为凤仙花Impatiens balsuminaL.的茎；对照品东莨菪内酯(批号MUST-21032415,HPLC法测得纯度≥99.44%)、山柰酚(批号MUST-20082818,HPLC法测得纯度≥99.30%)、槲皮素(批号MUST-21001104,HPLC法测得纯度≥99.12%),均购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1凤仙透骨草网络药理学研究

2.1.1活性成分及其作用靶点筛选

检索凤仙透骨草的所有中英文文献，整理其化学组分。在TCMSP数据库(http: //tcmspw.com/tcmsp.php)输入“凤仙透骨草”下载成分信息，将2处来源的化学成分信息合并去重。通过pubchem数据库(https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)分别获得各成分二维结构SDF格式图片，导入Swiss ADME平台(http: //www.Swiss ADME.ch/),以药代动力学胃肠吸收选择“High”,药物相似性前2个条件满足2个“YES”为筛选条件，得到凤仙透骨草潜在活性成分8个，见表1。将获取的活性成分SDF结构文件导入Swiss target prediction平台(http: //www.swisstargetprediction.ch/),预测活性成分潜在靶点。取评分大于“0.1”的靶点基因进行整合去重，得到化合物重要潜在靶点。

2.1.2疾病靶点的收集

以“Osteoarthritis”为搜索词，在GeneCard数据库(https: //www.genecards.org/)、OMIM数据库(https: //omim.org/)中搜索已公布的人类骨关节炎的相关基因，合并去除重复项后，分别得到骨关节炎相关靶点将其导出，共导出2 242个与骨关节炎相关的疾病靶点。

2.1.3药物-疾病交集靶点基因数据库构建

使用在线微生信平台(http: //www.bioinformatics.com.cn/),将凤仙透骨草活性成分作用基因与骨关节炎基因取交集，得到71个成分-疾病重叠靶点信息，韦恩图见图1。

2.1.4药物-疾病交集靶点蛋白互作网络的构建

在STRING数据库(https: //string-db.org/)中进行交集靶点蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络分别使用Cytoscape的“Network analyzer”插件，通过拓扑学分析计算出PPI网络各靶点节点的度值，根据节点度值大小选定网络中关键靶点基因，度值越大，该基因在PPI网络中的作用越大。活性成分-疾病靶点网络见图2,重合靶点见表2。

表1凤仙透骨草中8个活性化合物基本信息

图1凤仙透骨草成分-疾病靶点交集Venn图

图2药物-疾病靶点基因蛋白相互作用网络

2.1.5富集分析

将71个交集靶点基因上传到David数据库进行基因本体(gene ontology, GO)富集分析，得到具有统计学意义(P<0.05)的GO条目，共327条，其中生物学进程(biological process, BP)225条，细胞组分(cellular component, CC)39条，分子功能(molecular function, MF)63条，靶点基因主要参与凋亡过程负调控、参与血管生成、对氧化应激反应、正向调节ERK1/2级联反应等生物学进程等，主要在细胞质核周区、细胞外基质、线粒体、胞质等处发挥作用。参与的MF主要包括酶、蛋白质、蛋白质激酶、ATP及胰岛素受体的结合等。结果见图3,每个模块中P分值最小的前10个条目，其值越小越偏向红色，反之则偏蓝。气泡大小代表其富集基因数。

京都基因和基因组(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析结果显示，靶点基因富集于73条相关通路，图4中列出了P值排序最小的20个条目，靶点基因主要涉及到雌激素信号通路、RAS信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、血管内皮生长因子信号通路、趋化因子信号通路等，这些通路与细胞的炎症反应、氧化应激及转化、凋亡、增值及分化等生命过程密切相关。

2.1.6“药物-活性成分-靶点-通路”拓扑网络构建

使用Cytoscape 3.8.2软件构建凤仙透骨草与骨关节炎交集靶点的“药物-活性成分-靶点-通路”调控网络，采用“Network analyzer”插件进行网络拓扑参数分析得出上述网络中节点的度值，根据度值大小确定及靶点重要活性成分。如图5所示，图中按度值排名从高到低的化合物依次为槲皮素、矢车菊素、山柰酚、东莨菪内酯、秦皮乙素。

2.1.7活性成分-靶点分子对接验证

从PubChem数据库(https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载分子的结构式，再从PDB数据库(http: //www.rcsb.org/)下载核心蛋白结构域的pdb格式，通过Autodock Tools-1.5.7对靶蛋白进行除水、加氢、电荷，以及对不完整的残基进行修饰，再将蛋白-配体复合物中相关分子的坐标置于Grid Box,然后运行Vina脚本进行分子结合能计算。将度值排名前六的潜在活性成分与核心靶点进行分子对接，通常考虑结合能低于-4.0 kcal·mol-1,表明受体与配体有相应的结合能力；低于-5.0 kcal·mol-1,表明具有较好的结合活性；小于-7.0 kcal·mol-1,表明有强烈的结合活性[7-9]。由表3可知，各活性成分与核心靶点均有较好的结合活性，其中槲皮素、山柰酚和矢车菊素与PTK2、PTPN11、PTPN1等靶点有较强烈的结合活性。

表2药物-疾病核心靶点基因

图3 GO富集分析气泡图

图4 KEGG富集分析气泡图

图5药物-活性成分-靶点-通路调控网络

2.2凤仙透骨草治疗骨关节炎的质量标志物筛选

2.2.1供试品溶液的制备

称取透骨草粉末约2.0 g,甲醇浸泡过夜，超声(功率100 W,频率40 kHz)提取30 min,取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

表3活性成分与主要靶点的分子对接

2.2.2 LC-MS法

质谱条件： 离子源为ESI(电喷雾离子化)源，以正离子模式采集；AutoMSe模式采集一级、二级质谱解离碎片；电喷雾电压2 500 V,ESI离子源温度100℃;锥孔气流量50 L·h-1,去溶剂气流量500 L·h-1;一级碰撞能量10 eV,二级碰撞解离能量20～35 eV;数据采集范围为m/z50～1 250。

色谱条件：采用Waters C18(2.1 mm×100 mm, 1.7μm)超高液相色谱柱，流动相为超纯水(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0～2.78 min, 5%B→20%B;2.78～4.17 min, 20%B→28%B;4.17～6.95 min, 28%B→41%B;6.95～9.73 min, 41%B→45%B;9.73～11.12 min, 45%B→52%B;11.12～13.89 min, 52%B→62%B;13.89～16.67 min, 62%B→85%B;16.67～19.45 min, 85%B→90%B;19.45～22.23 min, 90%B→100%B;22.23～25.01 min, 100%B),流速0.2 mL·min-1,进样体积1μL,柱温30℃,自动进样器温度4℃。

2.2.3筛选结果

透骨草样品正离子模式下可筛选得到槲皮素、山柰酚及东莨菪内酯，总离子流图及3个成分的二级质谱图见图6。

图6凤仙透骨草正离子模式模式下TIC图(A)及各成分二级质谱图(B～D)

2.3活性成分含量测定方法的建立

2.3.1混合对照品溶液的制备

分别取东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚的对照品适量，精密称定，加甲醇分别定容至5 mL,配制成质量浓度为1.02、1.00、1.00 mg·mL-1的单一成分对照品储备液，精密量取槲皮素对照品储备液1.25 mL,山柰酚对照品储备液1.73 mL,东莨菪内酯对照品储备液0.72 mL,用75%乙醇定容至25 mL,制成每1 mL含槲皮素0.05 mg、山柰酚0.07 mg、东莨菪内酯0.03 mg的混合对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备

称取凤仙透骨草粉末(过4号筛)约5.0 g,加入75%乙醇50 mL,超声(功率100 W,频率40 kHz)提取30 min,旋蒸浓缩至约5 mL,离心(4 000 r·min-1,5 min),取上清液过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.3.3色谱条件

采用中谱科技RD-C18(4.6 mm×250 nm, 5μm)色谱柱，以乙腈(B)-0.1%醋酸(A)为流动相，梯度洗脱(0～10 min, 10%B→16%B;10～20 min, 16%B;20%～25 min, 16%B→16.5%B;25～50 min, 16.5%B→25%B;50～60 min, 25%B→25.5%B;60～80 min, 25.5%B→32%B;80 min, 32%B→100%B;80～90 min, 100%B;90～95 min, 100%B→10%B),流速1.0 mL·min-1,进样量20μL,柱温30℃,检测波长300 nm。

2.3.4专属性试验

精密移取“2.3.1”项下混合对照品溶液、“2.3.2”项下供试品溶液各20μL,按“2.3.3”项下色谱条件进样测定。结果表明，供试品溶液在对照品相同保留时间的出峰位置处分别与对照品色谱峰对应一致。色谱图见图7。

图7混合对照品(A)和凤仙透骨草样品(B)的HPLC色谱图

2.3.5线性关系考察

精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量，用75%乙醇分别稀释2、4、8、16倍，得系列质量浓度的混合对照品溶液。按“2.3.3”项下条件测定，以质量浓度为横坐标，仪器测定峰面积为纵坐标进行线性回归，东莨菪碱、槲皮素、山柰酚的回归方程分别为

Y=3.0×107X+103r=0.999 9

Y=2.0×107X-2.9×104r=0.999 9

Y=4.0×107X-2.2×104r=0.999 9

结果表明，东莨菪内酯质量浓度在0.002～0.030 mg·mL-1、槲皮素质量浓度在0.003～0.050 mg·mL-1、山柰酚在0.004～0.070 mg·mL-1内与峰面积线性关系良好。

2.3.6精密度试验

精密吸取“2.3.1”项下的混合对照品溶液20μL,按照“2.3.3”项下色谱条件连续进样6针。测定峰面积，计算东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为1.6%、2.5%、2.0%,表明仪器精密度良好，适用于透骨草中活性物质的测定。

2.3.7重复性试验

精密称取透骨草粉末6份，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3.3”项下色谱条件连续进样6针。测得东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚的平均百分含量分别为0.015 2%、0.005 1%、0.009 6%,RSD分别为2.3%、2.9%、2.4%,表明该方法重复性较好。

2.3.8稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液20μL,分别于制备后0、2、4、8、12、24 h,按照“2.3.3”项下色谱条件进样测定，计算东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为2.9%、2.0%、1.1%,表明供试品溶液中各物质在24 h内稳定。

2.3.9加样回收试验

精密称取9份已知各指标成分含量的透骨草粉末，分成3组，每组平行3份，按照50%、100%、150%的比例加入东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制成供试溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进行测定，结果东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚的加样回收率分别为102.5%、98.6%、100.2%,RSD分别为2.0%、1.8%、1.9%。结果表明，该方法加样回收率符合含量测定要求。

2.4 AHP-CRITIC混合加权法优化提取工艺

2.4.1 Box-Behnken响应面优化工艺试验设计

根据前期单因素试验结果，确定提取时间(A)(10、30、50 min)、乙醇浓度(B)(75%、85%、95%)、料液比(C)(5、17.5、30倍)为影响因素，提取次数固定为2次，利用Design-Expert 12软件，按-1、0、1的三水平编码，以各指标成分含量为响应值，进行Box-Behnken响应面试验设计。因素水平设计、试验安排及试验结果见表4。

表4响应面试验设计与结果

2.4.2 AHP法计算权重系数

将透骨草中的东莨菪内酯，槲皮素，山柰酚3个活性成分的优先顺序作为权重指标予以量化，通过确定各指标的优先顺序槲皮素、山柰酚、东莨菪内酯，构建成对比较矩阵，结果见表5。采用和积法求得东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚的权重系数分别为0.125 3、0.490 6、0.384 1,最大特征根(3.000),本次针对3阶判断矩阵计算得到CI值为0.000,RI值查表为0.520,因此计算得到CR值为0.000(<0.1),意味着本次研究判断矩阵满足一致性检验，计算所得权重具有一致性。

2.4.3 CRITIC法计算权重

将表4中的BBD试验结果进行标准化处理，[指标成分值=(实测值-最小值)/(最大值-最小值)],根据公式计算相应的对比强度(δj)、冲突性(fj)、信息量(cj)、指标权重(ωj),结果见表6,得到东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚的权重系数分别为0.348 4、0.357 3、0.294 3。

表5各活性成分成对比较矩阵

2.4.4 AHP-CRITIC混合加权法计算权重

通过AHP法和CRITIC法，分别计算出东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚的权重系数，按照复合权重，ω复合ij=ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij,计算得东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚3个成分的复合权重分别为0.131 5、0.528 0、0.340 5。

2.4.5综合评价结果的比较

采用AHP法、CRITIC法和AHP-CRITIC混合加权法计算的权重系数，分别对实验结果进行综合评分，结果见表7。从综合得分分析，对AHP法与CRITIC法、AHP法与AHP-CRITIC混合加权法、CRITIC法与AHP-CRITIC混合加权法两两进行相关性分析，相关系数分别为0.971、1.000、0.971,三者相关性显著(P<0.01),说明通过AHP法、CRITIC法和AHP-CRITIC混合加权法计算的综合得分具有一致性。从权重系数分析，AHP法与CRITIC法计算的权重系数相关性为0.105,二者相关性不显著(P=0.933>0.05),说明二者反映的信息不具有叠加性。综合考虑，选择AHP-CRITIC混合加权法。

表7 3种加权法综合评分结果

2.4.6数据处理与分析

运用Design-Expert 12软件对表4中各因素水平设计与AHP-CRITIC法计算的综合得分进行拟合，得回归方程：

Y=-404.15-3.62A+13.88B-7.75C+0.066AB-0.053AC+0.073BC-0.022A2-0.10B2+0.058C2r=0.976 6

其中Y表示综合得分，A表示提取时间得分，B表示乙醇浓度得分，C表示料液比得分。校正系数为0.945 6,说明该模型拟合度良好，试验误差小，可用此模型对综合评分进行分析和预测，对该模型进行方差分析，结果见表8。以综合得分为响应值，P<0.05,说明该回归方程显著，而失拟值P=0.700 3,不显著，说明未知因素对试验的干扰小。 利用Design-Expert 12软件得到方程等高线及响应面图，以确定最佳提取工艺参数，见图8。根据模型拟合结果，并结合实际操作情况，将优化后的透骨草提取工艺参数调整为加入5倍量82%乙醇，回流提取2次，每次35 min。

2.4.7工艺验证

根据优化后的最佳提取工艺，取透骨草药材3份，制得供试品溶液，测定并计算各项指标得出综合评分，结果见表9。表明优化后的提取工艺稳定可行，可用于凤仙透骨草药材的提取操作。

表8方差分析结果

图8各因素对综合得分影响的响应面

表9工艺验证结果

3、讨论

本研究采用网络药理学及分子对接技术对凤仙透骨草治疗骨关节炎的活性成分进行了预测，发现东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚等可能是其发挥作用的主要活性成分。这些活性成分作用于EGFR、SRC、AKT1、ESR1、PIK3R1、MMP9等关键靶点，进而通过参与雌激素信号通路、RAS信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等发挥治疗骨关节炎的作用。

骨关节炎发病机制与基质金属蛋白酶(MMP)、细胞因子、基因、免疫反应及血液循环等多种因素密切相关[10]。网络药理学预测结果显示凤仙透骨草中有多种治疗骨关节炎的潜在活性成分，但通过LC-MS技术分析后仅获得3个可测活性成分，故本研究选用东莨菪内酯、槲皮素、山柰酚3个物质进行考察。东莨菪内酯具有抗炎、镇痛的药理活性，是治疗骨关节炎的重要活性物质[11]。WAN-OSMAN等[12]研究表明东莨菪内酯可抑制糖胺聚糖及NO从软骨外植体中释放白细胞介素-1β(IL-1β),富含东莨菪素的海巴戟提取物可改善软骨结构并提高骨形成标志物PINP的水平。槲皮素具有抗炎、抑制破骨细胞吸收、抗细胞凋亡等活性作用，其体内外实验均表明槲皮素能显著降低炎性介质的形成，减少IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等细胞因子的表达与分泌[13-14],具有治疗骨关节炎的潜在药用价值。山柰酚及其糖苷具有抗炎、镇痛、抗癌等生理活性[15-17],研究表明山柰酚能以浓度依赖的方式导致IL-1β刺激的PEG2和NO形成减少，上调大鼠骨关节炎软骨细胞iNOS和Cox-2的表达，抑制IkBa的降解和NF-κB活化，具有显著的抗炎作用[18]。

本研究基于AHP-CRITIC混合加权法和Box-Behnken响应面法，通过统计学和数学方法于一体，最终确定了凤仙透骨草的最优提取方案为加入5倍量82%乙醇，回流提取2次，每次35 min。本实验中对凤仙透骨草提取工艺的优化其结果可作为开展实验研究的线索。采用多指标综合加权评分法时，各指标权重系数的赋予是综合评分是否科学合理的关键。层次分析法(AHP)是根据对一定客观现实的主观判断结构把专家意见和分析者的客观判断结果直接而有效地结合起来，将一层次元素两两比较的重要性进行定量描述，但是此方法个人主观因素对整个过程的影响很大，而CRITIC法适用于确定指标客观权重，更能体现客观数据信息。本研究通过加权求和的方式，将AHP法和CRITIC法相结合，兼顾主客观因素，得到指标的综合评分，使得综合评价更具有科学性、客观性和准确性[19-22]。

参考文献:

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基金资助:成都医学院-成都医学院第一附属中医医院临床科学研究基金项目(2022LHZYYB-07);成都医学院应用开发与成果转化培育项目(CYCG19-01);国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教函[2019]41号);

文章来源:穆雪峰,吴铭,周朝梅,等.基于网络药理学及混合加权法优化凤仙透骨草提取工艺[J].药物分析杂志,2024,44(11):1932-1943.