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复方美登木片中甘草苷含量测定研究

2024-02-18 102 上传者：管理员

摘要：目的:建立复方美登木片中甘草苷含量的高效液相色谱测定方法。方法:采用高效液相色谱法，Agilent C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5μm),以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速为1.0 mL/min,检测波长为237 nm,柱温30℃。结果:甘草苷线性范围为0.052～0.312μg (r2=0.999 7),平均加样回收率为101.04%,RSD=1.06%(n=6)。结论:该方法简便，准确可靠，可用于复方美登木片的质量控制。

关键词：
复方美登木片
有效性
甘草苷
辅助治疗
高效液相色谱法
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复方美登木片处方是普洱市民族医院进行民族医药文献调研时收集整理所得,源于傣族方记《档哈雅帕雅摩雅召片领景帕罕》(傣族宫廷内土司医生扎康郎香的医书———宫廷秘方集)[1],由美登木、重楼、海藻、甘草和白花蛇舌草等7味药组成,具有清热解毒、软坚散结之功效,用于经络瘀滞所致的乳房胀痛、刺痛,乳腺小叶增生、子宫肌瘤见上述证候者,也可用于乳腺癌辅助治疗。该方在普洱市民族医院以汤药形式使用多年,因其疗效显著而深受患者欢迎。2004年起,医院对复方美登木片进行系统性研究,开展制剂注册申报工作,并获得了云南省院内制剂批文。

复方美登木片质量控制内容主要为性状、薄层鉴别和片重等常规项检查,为改进药品质量控制方法,保证制剂的有效性和安全性,保障用药服务质量,实验开展了复方美登木片含量测定研究。海藻和甘草配伍为中医药的配伍禁忌,思茅民族医反用其治疗瘿瘤痈肿,是临床实践总结[2]。甘草中的主要成分为三萜类和黄酮类,其中,甘草酸及甘草苷分别是三萜类和黄酮类化合物中重要的单体活性成分,具有很强的药理活性[3]。目前,《中华人民共和国药典》以甘草苷和甘草酸为指标对甘草进行评价,甘草中的异甘草苷、芹糖甘草苷等黄酮类成分在抗心律失常及抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等方面均具有显著的疗效[4],甘草苷可通过活性氧介导的信号通路诱导肝癌细胞周期阻滞和凋亡[5]。实验选择甘草苷作为复方美登木片指标成分,建立其高效液相色谱(HPLC)测定方法,为复方美登木片的质量控制提供参考。

1、仪器与材料

1.1主要仪器

Agilent1260型HPLC仪,KQ250超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),MS205D电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)。

1.2材料

甘草苷对照品(批号:111920-201304,纯度95%);复方美登木片由普洱市民族医院制剂室制备(批号:210701、210702、210703、220501、220502、220503);乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为纯净水。

2、方法

2.1色谱条件[6,7,8,9,10]

色谱柱为AgilentC18柱(3.9mm×150mm,5μm);流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱;检测波长为进237nm;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;样量:10μL。见表1。

表1 复方美登木片梯度洗脱条件

2.2样品的制备

2.2.1对照品溶液

取适量甘草苷对照品,精密称定,加入70%乙醇制得每1m L含甘草苷26μg的溶液,即得。

2.2.2供试品溶液制备

取复方美登木片粉末(过三号筛)约1.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50m L,超声处理(功率250W,频率40k Hz)30min,定重法称量处理前后质量,用70%乙醇的溶剂补足损失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3阴性对照溶液

按处方配比除去甘草,依照复方美登木片制备工艺制得阴性样品,按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法配制。

2.3方法学考察[11,12,13,14]

2.3.1专属性试验

取甘草苷对照品溶液、复方美登木片供试品溶液和复方美登木片阴性对照品溶液各10μL,在上述色谱条件下,分别记录样品出峰图谱,见图1。

图1 HPLC图谱

由图1可知,甘草苷对照品溶液的保留时间为22.931min,复方美登木片供试品溶液指标峰的保留时间为22.965min,二者保留时间基本一致,而阴性对照品溶液在此保留时间内未出现相应的峰,表明采用该色谱条件,测定复方美登木片指标峰,无其他成分对其产生干扰,峰型对称,分离度好,专属性强。

2.3.2线性关系考察

分别吸取浓度为26μg/m L的对照品溶液2、4、6、8、10、12μL,相当于甘草苷0.052、0.104、0.156、0.208、0.260、0.312μg,在“2.1”色谱条件下进样分析,并记录不同进样量下对照品峰面积,以甘草苷质量为横坐标,甘草苷峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,复方美登木片甘草苷进样质量在0.052～0.312μg范围内,测定结果具良好的线性关系,回归方程为:Y=1796.97X+6.752,R2=0.9997。

2.3.3精密度实验

取对照品溶液,进样10μL,设定序列进样,连续测定6次,记录甘草苷指标峰面积。甘草苷峰面积的相对标准偏差RSD为0.20%,精密度良好。

2.3.4稳定性实验

取同一批号复方美登木片供试品溶液,在“2.1”色谱条件下,分别于0、2、4、6、8、12h测定含量。供试品溶液中甘草苷峰面积的相对标准偏差RSD为0.45%,表明复方美登木片供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.3.5重复性试验

精密称取6份同一批号复方美登木片,按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液,依次记录复方美登木片的指标峰出峰面积。复方美登木片样品中甘草苷含量的相对标准偏差RSD为0.5%,重复性好。

2.3.6加样回收率试验

精密称取6份同一批号复方美登木片样品0.75g,置100m L容量瓶中,于容量瓶中加入已知浓度的对照品溶液2.8m L,按“2.2.2”项下方法制备加样回收供试品溶液,进样10μL,测定甘草苷的峰面积,计算加样回收率。结果甘草苷平均加样回收率为101.04%,RSD为1.06%,表明该方法加样回收率符合要求,结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.3.7耐用性试验

取同一批号复方美登木片供试品溶液,分别在不同条件下,按照不同色谱条件进样测定,计算甘草苷含量和RSD。结果表明,所用方法耐用性良好,结果见表3。

2.3.8样品测定

取6个不同批号的复方美登木片样品(210701、210702、210703、220501、220502、220503),每个批次样品取2份,按供试品溶液制备方法制得待测样品溶液。分别记录6个批次复方美登木片中指标峰面积,计算6批样品甘草苷的含量,结果见表4。

3、讨论

处方由美登木、重楼、海藻、甘草和白花蛇舌草等7味药组成,方中重楼具有清热解毒、消肿止痛之功效,现代研究表明,甾体皂苷是重楼的主要活性成分,也是重楼药材质量控制的重要标准[15]。实验开展过程中,首先参照2020版《中华人民共和国药典》重楼项下重楼皂苷含量的测定方法,测定了6批次复方美登木片重楼皂苷含量,结果显示每1g成品,重楼皂苷Ⅰ最低含量为万分之0.5,重楼皂苷Ⅱ最低含量为万分之3.5,重楼皂苷Ⅷ在6个批次样品中均未检出,重楼皂苷含量较低;重楼皂苷吸收波长在203nm,为紫外末端吸收,检测灵敏度不高,且实验发现检测周期较长,容易出现保留时间波动,重现性差,不建议重楼皂苷列入含量测定标准[16]。

表3 耐用性试验结果

表4 复方美登木片中甘草苷的含量测定结果

复方美登木片已有多年的临床应用,质量标准始终沿用了初期制定的质量控制方式,无含量测定控制,为改进成品质量控制方法,保障患者的用药安全,采用HPLC方法,实现医院中药制剂的现代化研究,为复方美登木片的质量控制提供科学依据,实现中药制剂安全、有效、可控的良性发展。研究所得色谱图的分离度好,方法简单易行,重现性好,保留时间较合适,具有良好的适用性,可为复方美登木片的质量控制提供参考。

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