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超声提取金银花中绿原酸的正交试验设计

2024-06-02 25 上传者：金银花;绿原酸;超声提取;正交试验;

摘要：目的：为了获得金银花中绿原酸的最佳提取工艺参数。方法：对浸渍法和超声法两种不同的提取方法的效果进行比较，设计了超声法提取金银花中绿原酸的单因素试验和正交试验，对A乙醇浓度(40%、50%、60%)、提取时间(20 min、35 min、50 min)、超声温度(50℃、60℃、80℃)和液料比(20倍、35倍、40倍)这四个因素三个水平，考察其工艺参数的不同对金银花中绿原酸收率的影响和大小。结果：超声法提取金银花中绿原酸的单因素试验结果显示最佳乙醇浓度为50%，最佳时间是35 min，最佳温度是60℃，最佳液料比为35倍；正交试验影响因素大小为A>D>C>B，最佳提取工艺方案为A2B2C2D2。结论：超声法提取金银花所获得的绿原酸得率要比浸渍法金银花所获得的绿原酸得率要高，产率提高了0.19%；超声提取绿原酸的最佳工艺参数是乙醇浓度50%，提取时间35 min，超声提取温度是60℃，液料比是35倍。本工艺参数的优化，为使用超声法单因素试验和正交试验提取贵州金银花中的绿原酸提供了理论依据和数据支持。

关键词：
中成药
绿原酸
超声提取
金银花
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贵州地处云贵高原，气候温和湿润，适宜金银花和山银花的生长(柳小兰，2015)。2020年8月统计，贵州省的金银花和山银花的种植面积达80万亩，全国排名第二，占全国种植面积的22%，仅次于山东省。仅绥阳县、安龙县、务川县就有70万亩，其中山银花约60万亩，金银花约15万亩，产金银花0.2万吨，产山银花0.9万吨。

金银花，为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.d)干燥花蕾或带初开的花[1],2005版药典将金银花和山银花分列，忍冬科植物忍冬作为金银花药材的唯一来源。金银花具有清热解毒、疏散风热的功效[2]，是连花清瘟、银翘解毒、金叶败毒等中成药的主要药物。

目前，贵州的金银花产业发展不平衡不全面，主要以农户分散种植和粗加工为主，贵州省金银花和山银花药材以质量好、香气馨郁而具有良好的市场口碑，被湖南、重庆等地药商收购，主要销往全国各大药材市场(如成都荷花池、安徽亳州、河北安国中药材市场)以及广东、广西壮族自治区等[3]。金银花加工产业的资金投入和科研开发不足以及劳工人员的对外输出，使得贵州省的金银花加工产业发展相对落后，金银花的产品开发业仅仅处于初级状态。

1、引言

金银花和山银花的主要有效成分是绿原酸和异绿原酸[4]，绿原酸是咖啡酸与奎宁酸(1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，易溶于水、醇液和丙酮等溶剂[5]，其结构含有双键、酯键和多元酚等不稳定性结构，使得绿原酸受到外界因素的影响而容易发生水解反应和氧化反应，所以绿原酸的提取工艺就受到了提取方法、提取温度、提取时间、所用溶剂以及等诸多因素的影响。

金银花的提取方法主要有煎煮法、浸渍法、回流法和超声法等方法。

煎煮法提取金银花，由于加热温度较高极易使绿原酸氧化分解，致使绿原酸的产率较低，其提取工艺的使用受到了限制；浸渍法提取绿原酸，需要在温度较低的环境中进行，且前后从提取工艺以及到测定绿原酸得率所用的时间不能太长，避免提取液容易发生霉变而影响试验进程和绿原酸的得率；回流法和超声波法提取绿原酸的产率较高，尤其是超声波具有机械效应、搅拌效应和加热效应，其提取绿原酸的工艺具有不破坏提取物、操作相对简单和提取产率较高的特点而备受青睐。

本研究以贵州绥阳的金银花为材料，先对浸渍法和超声提取金银花中的绿原酸产率进行对比，然后采取超声法进行单因素试验，先后考察乙超声温度(℃)、超声提取时间(h)、乙醇浓度(%)和液料比(倍)对绿原酸提取率的影响，再在单因素试验的基础之上进行超声法正交试验设计探索金银花中有效成分绿原酸提取工艺，研究贵州金银花的提取工艺参数，以期获得提取金银花中绿原酸的最佳的工艺，为贵州金银花资源的开发和质量控制提供理论基础和数据支持。

2、实验部分

2.1 试剂和仪器

甲醇(色谱纯)，乙醇(分析纯)，磷酸(分析纯)，盐酸(分析纯)，绿原酸标准品(HPLC≥99%)，金银花(购于贵州绥阳，为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾)。

水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)，药物粉碎机(北京长安科学仪器有限公司)、高速离心机TG16(上海卢湘仪器离心机有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，电子天平(奥豪斯国际贸易有限公司)，高速液相色谱仪LC-16(岛津仪器有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海博讯医疗生物仪器有限公司)，超声波处理器(KQ-400DE)。

2.2 实验过程

结合相关文献[6,7,8,9,10,11,12,13]，为了获得最佳提取工艺参数，本项目先采用浸渍法和超声法进行比较，然后进行超声法的单因素试验和正交试验设计。

2.2.1 浸渍法和超声提取法比较

绿原酸结构中含有酯键，在碱性条件下容易发生水解反应，为了获得较好的提取效果，需要控制提取溶液的酸碱性，设计以下实验流程如下，金银花烘干，粉碎过20目筛，称取金银花粉末5.00 g置入圆底烧瓶中，加入一定体积的乙醇，调节pH为6，浸泡2小时，在一定的参数条件下进行浸渍法和超声法提取金银花中绿原酸，过滤，3000 r/min离心10 min，取上清液，加蒸馏水定容至150 mL，混匀，精密吸取10µL，注入色谱仪，检测波长为254 nm，柱温为室温，流动相中A液为甲醇，B液为0.55%磷酸水溶液，进样量为10µL，测定绿原酸的提取率。

2.2.2 单因素试验超声法

本文采用固定其他因素不变，只改变一个因素的水平的策略，来探索单因素对提取效果的影响大小，单因素试验及水平表见表1。

表1单因素试验及水平表

2.2.2. 1 超声温度对金银花中绿原酸提取率的影响

称取金银花粉末5.00 g置入圆底烧瓶中，加入100 mL的50%的乙醇溶液，调节pH为6浸泡2小时，分别于30℃、50℃、60℃、70℃和80℃下超声提取30 min，过滤，3000 r/min离心10 min，取上清液，加蒸馏水定容至150 mL，混匀，精密吸取10µL，注入色谱仪，检测波长为327 nm，柱温为室温，流动相中A液为甲醇，B液为0.55%磷酸水溶液，进样量为10µL，测定绿原酸的提取率。

2.2.2. 2 超声时间对绿原酸提取率的影响

称取金银花粉末5.00 g置入圆底烧瓶中，加入100 mL的50%的乙醇溶液，于50℃下分别超声提取20 min、30 min、40 min、50 min和60 min，后续操作方法同2.2.2.1。

2.2.2. 3 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响

称取金银花粉末5.0 g于圆底烧瓶，分别加入100 m L浓度为30%、40%、50%、60%和70%的乙醇溶液，于50℃下超声提取30 min，后续操作方法同2.2.2.1。

2.2.2. 4 液料比对绿原酸提取率的影响

称取金银花粉末5.0 g于圆底烧瓶，分别加入液料比10倍、20倍、30倍、40倍和50倍的乙醇溶液，于50℃下超声提取30 min，后续操作方法同2.2.2.1。

2.2.3 正交试验超声法

为了获得绿原酸的最佳提取工艺，本文在单因素试验的基础之上，采取正交试验设计对金银花的超声提取工艺进行探讨，优化超声提取金银花中绿原酸试验的参数，以期获得最佳提取工艺。我们确定以下4个考察对象分别为乙醇浓度(40%、50%、60%)、提取时间(20 min、35 min、50 min)、超声温度(50℃、60℃、80℃)和液料比(20倍、35倍、40倍)进行考察，根据以上因素的参数范围和金银花中绿原酸提取的得率，每个考察因素设立3个水平，即采用L9(34)的超声法提取金银花中绿原酸的正交试验设计，正交试验因素及水平表见表2所示。

表2正交试验因素及水平表

3、结果与讨论

3.1 浸渍法和超声提取法的结果比较

浸渍法和超声法两种不同的提取方法，在确定的提取参数下(乙醇浓度为70%，提取时间为1小时，提取温度为50℃，料液比为15倍)，如表3所示。浸渍法所得的绿原酸的得率是2.54%，超声提取法绿原酸的得率是2.73%，说明超声法金银花中的绿原酸要比浸渍法提取金银花中的效果好，产率提高了0.19%。这是因为超声波的空化效应和机械效应有利于增加介质分子的运动速度和的穿透力，增加金银花的破壁效应和释放效应，从而提高了绿原酸分子的溶出效果。

表3浸渍法和超声法提取绿原酸的比较

3.2 超声法单因素试验结果

3.2.1 超声温度对金银花中绿原酸提取率的影响

由图1所示可知，在30～60℃时金银花中绿原酸的提取率随着超声温度的升高而逐渐增大，因为温度升高，使金银花中绿原酸的溶出速度及扩散速度加快，提取率显著提高。在超声温度为60℃时，金银花中绿原酸的提取率最高。随着温度的升高，绿原酸提取率反而下降，可能是因为金银花中绿原酸随着温度的升高部分有效成分中的双键和酚类结构被氧化而发生分解反应，故选超声提取的温度为50℃、60℃和80℃进行正交试验设计。

图1超声温度对金银花中绿原酸提取率的影响

3.2.2 超声时间对绿原酸提取率的影响

图2超声时间对金银花中绿原酸提取率的影响

由图2可知，提取时间在20～35 min范围增加，超过35 min后由于金银花中的绿原酸已基本提出，提取率升高相对平缓，再增加提取时间将对金银花中的绿原酸的收率影响意义不大，故选择超声提取的时间为20 min、35 min和50 min进行正交试验设计。

3.2.3 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响

由图3可知，乙醇浓度在30%～50%范围内金银花中绿原酸提取率随乙醇浓度的升高而增大，乙醇浓度为50%时提取效果较好，这可能是因为50%乙醇浓度的极性更接近金银花中绿原酸的极性，使金银花中绿原酸分子得到较充分的释放和扩散。乙醇浓度在50%～70%范围内，绿原酸的提取率反而降低，这可能是因为高浓度的乙醇溶液使细胞内的蛋白质变性而凝固，绿原酸不易溶出，致使金银花中绿原酸的提取率降低，故选择乙醇浓度为40%、50%和60%进行正交试验设计。

图3乙醇浓度对金银花中绿原酸提取率的影响

3.2.4 液料比对绿原酸提取率的影响

由图4可知，液料比在10～35倍之间，绿原酸提取率随着液料比的增加而逐渐升高；液料比在35～50倍之间提取率升高开始下降，随着乙醇溶剂使用量的增加，绿原酸提取率增加有限，对绿原酸提取率影响很小。故选择液料比为20倍、35倍和40倍进行超声的正交试验设计。

图4液料比对绿原酸提取率的影响

3.3 超声回流法正交试验结果

为了获取最佳提取效果，在超声法单因素试验的基础之上，我们进行考察乙醇浓度(40%、50%、60%)、提取时间(20 min、35 min、50 min)、超声温度(50℃、60℃、80℃)和液料比(20倍、35倍、40倍)三水平四因素的正交试验对金银花中绿原酸提取率的影响，正交试验结果见表4。

由表4中的数据：可知：(1)由极差的数据大小可知影响因素大小为A>D>C>B，最佳提取工艺方案为A2B2C2D2，即乙醇浓度50%，提取时间35 min，超声提取温度是60℃，液料比是35倍。(2)乙醇的浓度对于绿原酸提取率的影响比较大，乙醇的浓度过大过小对金银花中绿原酸的提取率都有很大的影响，乙醇的浓度太小达不到绿原酸的极性会使得溶出效果较差，当乙醇的浓度为50%时提取效果最好，这可能是因为此时的极性跟绿原酸的极性接近有利于绿原酸分子的溶出，当乙醇浓度过大会使得金银花中的蛋白质发生变性反应而不利于绿原酸分子的溶出，使得绿原酸的提取率下降。(3)液料比对于绿原酸的提取影响较大，绿原酸提取率随着液料比的增加而逐渐升高，35倍的液料比即可取得最好的提取效果；随着乙醇溶剂使用量的增加，绿原酸提取率增加有限，对绿原酸提取率影响很小。(4)提取温度对目标产物绿原酸的收率影响较大，温度太低不利于绿原酸分子运动，绿原酸的溶出效果不好而造成绿原酸的提取率不高，最佳的温度是45℃；温度太高容易使得绿原酸中的双键和多元酚氧化分解，使得绿原酸的提取率降低。(5)超声提取时间太少都不利于绿原酸的溶出，为了绿原酸达到溶解平衡，且取得最好的收率是35 min，再增加超声提取时间此时提取率升高相对平缓，将对金银花中的绿原酸的收率影响意义不大。

表4正交试实验结果

4、结论

超声法提取金银花所获得的绿原酸得率要比浸渍法金银花所获得的绿原酸得率要高，产率提高了0.19%；超声法提取金银花中绿原酸的单因素试验结果显示最佳乙醇浓度为50%，最佳时间是35 min，最佳温度是60℃，最佳液料比为35倍。

超声法提取金银花中绿原酸的正交试验设计结果表明四个影响因素大小为A>D>C>B，最佳提取工艺方案为A2B2C2D2，表明超声提取绿原酸的最佳工艺参数是乙醇浓度50%，提取时间35 min，超声提取温度是60℃，液料比是35倍；本工艺参数的优化，为使用超声法单因素试验和正交试验提取贵州金银花中的绿原酸提供了理论依据和数据支持。

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