板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort的根，味苦，性寒，归心、胃经，具有清热解毒之功效[1]。现代研究表明，板蓝根含多种化学成分，具有抗菌、抗病毒、免疫增强、活血化瘀等多种药理作用，临床应用范围广、需求量大[2-5]。矮壮素是一种促进植物根部生长并壮大的植物生长调节剂(PGR),为提高产量和经济效益，根类中药材种植过程存在普遍使用矮壮素的情况[6-8]。

板蓝根相关研究多集在化学成分、作用机制以及营养元素、有害元素分析方面[9-15],缺乏较全面系统的板蓝根元素分布研究，更无施用植物生长调节剂对其元素分布影响的研究。植物的常量及微量元素影响着其根系营养及生理活动，在许多生物合成酶中起关键作用，参与糖、蛋白质、脂类等的代谢，不仅与中药材代谢产物形成和积累密切相关，也是药效发挥不可缺少的重要组成部分[16-20]。

本实验采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法建立了板蓝根中35种无机元素测定方法，并用以研究施用矮壮素的板蓝根样本中无机元素分布与变化情况，以期为板蓝根无机元素物质基础和施用植物生长调节剂后相关成分变化研究奠定基础。

1、材料

1.1 仪器

CEM7800电感耦合等离子体质谱仪、Mars 6微波消解仪(美国CEM公司);Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司);Zentrifugen D78532 Tuffingen离心机(德国Hettich公司)

1.2 试剂

铍(Be)、钠(Na)、镁(Mg)、铝(Al)、钾(K)、钙(Ca)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、砷(As)、硒(Se)、钼(Mo)、钌(Ru)、钯(Pd)、银(Ag)、镉(Cd)、锡(Sn)、锑(Sb)、碲(Te)、钡(Ba)、钕(Nd)、镝(Dy)、铒(Er)、铱(Ir)、铂(Pt)、汞(Hg)、铊(Tl)、铅(Pb)、铀(U)单元素标准溶液均购自国家标准物质中心，质量浓度均为1.000 g/L。内标溶液为含锂(Li6)、钪(Sc)、锗(Ge)、铟(In)、铋(Bi)元素的混合溶液(浓度为10 μg/mL);硝酸、盐酸、氢氟酸均为优级纯(德国Merck公司);水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.3 药材

田间试验基地位于山东省德州市夏津县东李镇韩庄村，属暖温带半湿润大陆性季风气候。参考菘蓝同科属植物油菜的田间药效试验，设置矮壮素低(500 mg/L)、中(1 000 mg/L)、高(1 500 mg/L)剂量组施药，空白组喷洒清水。不同剂量组间按照农药残留试验准则要求设计，每个试验小区面积为15 m2,小区间隔离带为30 cm, 各剂量组均设4次重复(4个区组平行，图1)。

试验采用随机区组设计，矮壮素在生长中期(叶长约30 cm时)采用叶面喷施，每隔7 d左右施药1次，共施药4次，分别于第1次施药后15 d(9月15日采样)和第4次施药后30 d(11月1日)采样。

采样按照“交叉五点法”,随机采集生长正常菘蓝样本，除去泥土，晒干，取根部，按照四分法取样，切段后粉碎成粗粉。收集田间试验的空白组及矮壮素低、中、高剂量组样本，每组4份(每个区组一份),2次采样样本共32份。

2、方法与结果

2.1 分析条件

射频功率1 550 W;采样深度8.0 mm; 载气流速0.9 L/min; 载气补偿气流速0.3 L/min; 样品提升速率0.1 rps; 积分时间0.3～3.0 s; 重复次数3次。碰撞气为氦气(4.3 mL/min),正常模式与氦气模式平衡时间为15 s。

2.2 对照品溶液制备

精密量取Hg元素标准溶液适量，用5%硝酸-盐酸(4∶1)溶液配制成每1 mL含1 μg Hg的储备液1;再精密吸取其余各元素标准溶液，用5%硝酸-盐酸(4∶1)溶液制成每1 mL含K、Na、Mg、Ca、Fe各100 μg, 含其余元素各1 μg的储备液2。

图1 田间试验小区分布图

注：ACK为空白组，A1为低剂量组，A2为中剂量组，A3为高剂量组。

2.3 供试品溶液制备

取板蓝根粗粉0.5 g, 精密称定，置于耐压耐高温微波消解罐中，加硝酸-盐酸(4∶1)5 mL,加盖密闭，将消解罐放入消解仪中按既定程序消解。消解完毕后，冷却至罐内温度小于60 ℃,取出，放冷，小心开启消解罐，将消解后的溶液转移至50 mL聚四氟乙烯量瓶中，用水洗涤罐盖及罐壁数次，合并洗液置于量瓶中，加入金标准使用液50 μL,加水稀释至刻度，混匀，即得。同法制备空白试剂。

2.4 测定法

精密吸取内标溶液适量，用5%硝酸溶液稀释成1 μg/mL的内标溶液，以正常和氦气双模式测定，在线加入内标，各元素质量数、测定模式及内标选择见表1。以供试品中待测元素和内标元素响应的比值，扣除相应试剂空白后，代入标准曲线回归方程计算质量浓度。

表1 分析元素质量数、内标物及测定模式

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

以5%硝酸-盐酸(4∶1)溶液配制分别含K、Na、Mg、Ca、Fe元素0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL和其他29种元素0、1、5、10、20、50、100 ng/mL的系列质量浓度溶液；另配制含Hg元素0、0.2、0.5、1、2、5 ng/mL的系列质量浓度溶液，以各元素与内标计数值的比值为纵坐标(Y),各元素质量浓度为横坐标(X)进行回归，绘制标准曲线，结果见表2,可知各元素在各自范围内线性关系良好(r>0.999)。

2.5.2 检测限与定量限

测定21份空白溶液，计算各元素浓度的标准偏差(σ),以3σ作为最低检测限，以10σ作为最低定量限，代入样品计算公式(取样0.5 g、定容至50 mL)得方法检测限和定量限，结果见表2。

2.5.3 重复性试验

取6份板蓝根样品(空白组样1),按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，结果Se、Ru、Ag、Sn、Te、Er、Ir、Pt、Hg、Tl、U等元素含量接近检测限或未检出。故以“2.5.4”项下加样中间浓度制备6份供试品溶液，进行重复性试验，结果35种元素含量RSD为0.6%～9.6%(表2)。

2.5.4 加样回收率试验

取9份板蓝根样品(空白组样1),分别加入35种元素对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备高、中、低浓度加样水平供试品溶液，低浓度和高浓度各3份，中间浓度6份，在“2.1”项条件下进样测定，测得35种元素的平均加样回收率均在80%～115%之间(表2)。

表2 方法学考察结果

2.6 样品测定

对32批田间试验样品进行测定，结果显示，板蓝根中35种元素总量约2.5%,其中K约占1.5%,为主要大量元素；次含量元素Ca、Mg、Na、Fe、Al分别为0.6%、0.2%、0.08%、0.06%、0.04%;微量元素Zn、Mn、Ba、Cr、Mo、Cu、Ni分别为12.8、8.9、5.1、1.4、1.2、2.2、1.2 mg/kg; V、As、Nd、Pb、Co等元素含量极低(0.1～0.35 mg/kg);其他17种元素含量均小于0.05 mg/kg或未检出(表3)。其中As、Cd、Hg、Pb、Cu 5种重金属及有害元素含量均远远小于植物药参考限量[21],表明板蓝根的重金属及有害元素的安全风险较低。

2.7 数据分析

2.7.1 板蓝根中元素相关性分析

采用IBM SPSS Statistics 26软件分析不同剂量组样本中主量、次量及微量等13种元素相关性，结果见表4。由此可知，第1次采样空白组元素有5对相关，Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Ni 6种元素间呈显著或极显著正相关；随着生长时间推移，第2次采样空白组中相关元素增加为10对，Ca、Mg、Na、Al、Fe、Mn、Ba、Ca、Zn、Cr、Ni 11种元素间呈显著或极显著相关，且Mg-Na呈显著负相关。元素相关性的变化表明植物不同时期元素间的协同或拮抗存在既定差异和规律。

第1次采样低、中、高剂量组中相关元素分别为6对、7对和10对，较同时期空白组增加，除Fe、Cr、Ni、Mn元素外，K、Na、Mg、Al、Mo等元素间呈显著或极显著相关；第2次采样低、中、高浓度样本中呈显著或极显著相关分别为15对、33对和12对，仍比同时期空白组元素对增加，且中剂量组元素相关性呈Ca-Mg-Fe-Al-Zn-Mn-Ba-Cu和Cr-Cu-Ni 2条相关通道，高剂量组元素间相关性对数较中剂量组少，Cr-Ni在不同时期和不同剂量组均呈显著相关或极显著相关。

表3 样品测定结果及变异系数(mg/kg,n=4)

表4 不同剂量组元素相关性分析结果

图2 2次采样时间不同剂量组样本的OPLS-DA得分散点图

图3 2次采样时间的空白样本OPLS-DA得分散点图

2.7.3 板蓝根中差异元素的分布变化分析

对2次采样样本的显著差异元素Fe、Mn、Al、Mo、Na、Cr、Ni及主量K等分布变化进行分析，发现2次采样空白组板蓝根中Cr、Ni、Fe、Al含量随着生长时间推移有较明显增加，Mn、Mo、Na、K元素则组间含量差异不明显，且区组样本差异明显变小。与同时期空白组比较，第1次施用药后的不同剂量组Cr、Ni含量均有所下降，高剂量区组样本Cr元素差异变小，Ni元素基本无变化，Fe、Al含量随施药剂量增加而略上升；随着植物生长和施药次数增加，第2次施药后低剂量组Cr、N含量明显增加，中、高剂量组Cr、Ni含量则与空白组基本相当；不同施药剂量组Fe、Al含量略低于空白组。Mn、Mo、Na、K元素含量随施药剂量和次数呈现不同变化规律，即略升高或降低趋势，结果见图6。

图4 2次采样时间不同剂量组样本的OPLS-DA VIP图

图5 2次采样时间的空白样本OPLS-DA VIP图

图6 不同采收时间及不同剂量组板蓝根样本中8种元素变化规律(n=4)

3、讨论和结论

本实验以准确、专属的方法明确了板蓝根中无机元素分布特征，揭示了板蓝根生长过程中元素相关性及含量变化规律，对矮壮素干预的板蓝根样本无机元素分布及变化规律进行研究。

施用矮壮素后，低、中、高剂量组中相关元素较同时期空白组增加，植物中元素发生了复杂的相互协同或拮抗变化及部分元素含量分布特征改变，进而可能对其初生和次生代谢产物产生影响。不同时期样本存在较明显聚类，但同时期样本的不同剂量组之间无明显区分，说明植物内元素分布与生长时间关系密切。研究表明，板蓝根生长过程伴随一定规律的元素分布变化，但施用矮壮素后，植物对元素的吸收利用被影响，植物为维持需求平衡产生应激反馈，最终呈现出复杂的元素变化。本研究为板蓝根物质基础及施用植物生长调节剂后代谢物变化的深入研究提供了参考依据。

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基金资助:上海市中药和保健食品品质与安全检测专业技术服务平台(21DZ2290200);

文章来源:胡青,李丽敏,周如洁,等.基于ICP-MS研究矮壮素对板蓝根中无机元素分布的影响[J].中成药,2024,46(08):2809-2815.