衰老是一种正常而复杂的生物学过程，皮肤作为人体最表面的器官，其衰老是人体衰老最直接具体的表现[1-2]。在衰老过程中，皮肤会变薄，出现皱纹，弹性减退，脆性增加，色素沉着，严重影响老年人的生活质量[3-4]。目前改善皮肤老化的方法有视磺酸治疗、激素治疗、化学剥脱术、射频联合点阵激光治疗、注射肉毒毒素、填充剂、干细胞等。然而，这些方法的持续效果时间短，需要反复治疗，有的还会发生毒副作用。中药因其天然安全、作用平稳及毒副作用小等优势，成为药物抗皮肤老化的新热点[5]。

党参是传统的健脾补益类中药。研究[6-7]表明，党参水提物具有清除体内自由基、调节免疫系统、修复细胞DNA损伤的作用。伍春等[8]用党参多糖干预D-半乳糖致衰老模型小鼠，发现衰老模型小鼠的皮肤组织病理形态有明显改善，皮肤组织的抗氧化能力和胶原蛋白含量都有所增强。王明月等[9]发现潞党参可以调节老化小鼠皮肤组织中的炎症因子肿瘤坏死因子（TNF)-α、白细胞介素（IL)-6、IL-15的含量，减少皮肤炎症。潞党参口服液可通过调控皮肤细胞中Fas/FasL信号通路，抑制细胞凋亡，对光老化皮肤有一定的保护作用[10]，但是现阶段的研究集中于组织和细胞水平。鉴于中药活性成分和作用靶点较多，并且皮肤老化的机制复杂，因此，应用计算生物学方法，通过对相关数据库和算法的分析和整理，构建药物作用的分子靶点及调控网络，可为研究皮肤老化的机制以及党参的干预作用提供更多的数据和研究思路。因此，本研究拟建立D-半乳糖诱导小鼠衰老模型，给予党参水提物进行干预，联合计算生物学技术预测党参干预皮肤老化的核心靶点，用分子生物学方法验证靶点及所在通路的调控，挖掘党参水提物抗皮肤老化的分子机制。

1、材料与方法

1.1 动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠50只，8周龄，体质量为（20±2)g，购于甘肃中医药大学科研实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，质量合格证号：62001000000652。本实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准，批文号：2020-309。动物饲养于甘肃中医药大学科研实验动物中心SPF级实验室，自然光照，室温：20～25℃，自由摄食和饮水。

1.2 药物、试剂和仪器

党参，购自陇西保和堂药业有限责任公司，批号：20190627，制备成含原药材0.5 g·mL-1党参水提物，4℃冰箱保存备用；D-半乳糖、4%组织细胞固定液，北京索莱宝科技有限公司，批号：1013I055、20210103；高纯度RNA提取试剂盒，北京全式金生物技术股份有限公司，批号：Q61204；反转录试剂盒、TB Green®Premix Ex Taq™II (TliRNaseHPlus）试剂，宝日医生物技术有限公司，批号：AL50894A、ALE1618A；苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染液、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）试剂盒、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒、羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）试剂盒、总蛋白定量试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20210326、20220827、20220823、20220820、20220913；磷酸盐缓冲液（PBS），美国HyClone公司，批号：AF29526788;RIPA裂解液，碧云天生物技术有限公司，批号：P0013;ECL超灵敏化学发光试剂盒，上海雅酶生物医药科技有限公司，批号：03731150；基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotein 9,MMP9）抗体，美国GeneTex公司，批号：GTX100458;NF-κB P65抗体、IκBα抗体、IKKα抗体，美国CST公司，批号：8242T、4812S、11930T。

IX73荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；HT7800透射电子显微镜，日本日立公司；TY2018000209超声波组织细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TY2023000178高速冷冻离心机、TY2016000064高速离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；SpectraMax®i3x多功能酶标仪，美国美谷公司；23T12NP6500-527扫膜仪，上海天能生命科学有限公司。

1.3 动物模型复制及药物干预

小鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法随机分为正常对照组，衰老模型组和党参低、中、高剂量组。衰老模型组及党参各剂量组小鼠每日腹腔注射D-半乳糖溶液复制衰老模型小鼠，D-半乳糖溶液浓度为10 mg·mL-1，给药体积为20 mL·kg-1，正常对照组腹腔注射等量氯化钠注射液[11]。造模的同时党参低、中、高剂量组小鼠分别灌胃党参水提物（5、10、15 g·kg-1），给药体积为20 mL·kg-1。正常对照组和衰老模型组小鼠灌胃等量氯化钠注射液，以上造模连续42 d。

1.4 组织病理学检查

给药结束后，颈椎脱臼法处死小鼠。取小鼠背部脱毛后的皮肤组织切成1 cm×1 cm小块，置于4%多聚甲醛中常温固定。组织块变性完全后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后石蜡包埋。石蜡切片后将切片依次放入二甲苯、梯度乙醇、蒸馏水中进行常规脱蜡处理。洗涤后进行苏木精-伊红染色法（HE）和马松（Masson）染色，中性树胶固定封片，用光学显微镜观察。

1.5 生化检测

取小鼠背部脱毛后皮肤组织块约0.05 g，预冷生理盐水漂洗后除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称质量。量取该组织块9倍质量的预冷生理盐水，用匀浆器制成10%组织匀浆液；浆液以3 500 r·min-1的速度4℃离心10 min（离心半径为8.5 cm）。取其上清液，按照试剂盒说明书测定小鼠皮肤组织中SOD、MDA和HYP的含量。

1.6 透射电镜观察

将背部脱毛后的小鼠皮肤组织切成1 mm3的小块，加入2.5%戊二醛4℃避光过夜固定。然后，用PBS液漂洗3次，每次15 min。用1%锇酸4℃固定1 h,PBS液漂洗3次；组织依次放入梯度乙醇中脱水；100%丙酮置换2次；环氧树脂浸透包埋后切片；醋酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色15min；双蒸水漂洗，切片室温干燥过夜；最后用透射电子显微镜观察。

1.7 计算生物学预测党参干预皮肤老化的核心靶点

以“skin aging”作为检索词，在GEO基因表达综合数据库中进行检索。最后选取数据集GSE107361和GSE181022表达谱芯片作为最终研究样本。数据集GSE107361包括18组年轻（0～5岁）和10组老年（40～66岁）人类志愿者皮肤样本的基因芯片数据[12]。该片段检测平台为GPL570(HG-U133＿Plus＿2) Affymetrix Human Genome U133Plus 2.0 Array。数据集GSE181022包括27组年轻（0～5岁）和18组老年（40～66岁）人类志愿者皮肤样本的基因芯片数据[13]。检测平台均为GPL16686 Affymetrix Human Gene 2.0 ST Array。运用R语言对芯片数据进行归一化处理，并以log2(FC）的绝对值>1和P<0.05为筛选标准，对芯片数据进行差异筛选。应用TCMSP数据库检索党参活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18对结果进行筛选，剔除没有靶点的活性成分，获得党参活性成分及其对应的作用靶点。用UniProt数据库对作用靶点进行基因名标准化，将党参活性成分作用靶点与皮肤老化差异基因在Venny 2.1.0平台映射取交集，绘制韦恩图，得到党参-皮肤老化的交集靶点[14]。通过STRING数据库构建核心基因蛋白互作（Proteinprotein interaction,PPI）网络[15]。

1.8 实时荧光定量PCR法检测基因的相对表达量

采用高纯度RNA提取试剂盒提取各组小鼠皮肤组织总RNA，经过逆转录后，用TBGreen®PremixEx Taq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒检测核心基因MMP9 mRNA表达水平，以β-actin为内参，数据采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。引物序列信息见表1。引物由西安擎科泽西公司合成。

表1 引物序列

1.9 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白的表达

用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解皮肤组织；冰上剪碎组织并用研钵研磨；超声粉碎后，将制备好的匀浆液在4℃、12000r·min-1的条件下离心10 min（离心半径为8.5 cm）；吸取上清，用蛋白定量试剂盒确定蛋白浓度。将上清按3∶1的比例加入4×蛋白上样缓冲液，100℃煮样10 min后，加入12%的分离胶进行电泳，条件为恒压80 V、30 min,120 V、1 h 40 min。转到PVDF膜，条件为恒流200 mA、2 h。用5%的脱脂牛奶在室温下封闭PVDF膜2 h，加一抗4℃过夜孵育。使用的一抗包括：MMP9、IκBα、IKKα、NF-κB P65。TBST洗膜4次后，加二抗室温孵育1 h，以β-actin作为内参，蛋白质免疫印迹超敏发光显色液显色，用扫膜仪扫描后分析条带灰度值。

1.1 0 统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism软件进行作图。计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织病理结构的影响

HE染色结果见图1。正常对照组小鼠皮肤组织结构完整，真皮层的胶原纤维分布均匀且排列整齐，成纤维细胞和皮肤附属器较多；衰老模型组小鼠表皮变薄，结构不完整，皮肤附属器减少，胶原纤维减少且排列疏松，成纤维细胞数量减少；经党参水提物干预后，小鼠皮肤组织结构趋于完整，胶原纤维增多且排列较为有序，其中党参中、高剂量组的小鼠皮肤组织结构基本完整，胶原纤维增多且排列有序，可见较多的皮肤附属器。

Masson染色结果见图2。正常对照组小鼠皮肤组织胶原纤维完整、分布均匀且排列整齐；衰老模型组小鼠皮肤组织胶原纤维明显减少，排列稀疏且紊乱；经党参水提物干预后，党参低剂量组小鼠皮肤组织胶原纤维增加，但排列比较紊乱；党参中、高剂量组小鼠皮肤组织胶原纤维含量增多，排列比较致密、整齐。

2.2 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织SOD、MDA和HYP含量的影响

见图3。与正常对照组相比，衰老模型组皮肤组织SOD活性明显下降（P<0.05),MDA含量明显升高（P<0.05),HYP含量明显下降（P<0.05）；与衰老模型组相比，党参低、中、高剂量组皮肤组织SOD活性明显升高（P<0.05),MDA含量明显减少（P<0.05),HYP含量明显增高（P<0.05）。

图1 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织结构的影响（HE染色，×200)

图2 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织纤维的影响（Masson染色，×200)

图3 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织中SOD、MDA、HYP水平的影响（±s,n=3)

2.3党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织细胞超微结构的影响

透射电镜观察结果见图4。正常对照组小鼠皮肤成纤维细胞结构完整且呈不规则形，核染色较深，核内染色质分布均匀，有较多的粗面内质网和线粒体，脂褐素颗粒较少；衰老模型组小鼠皮肤成纤维细胞损伤严重，胞质很少，变性坏死的粗面内质网较多，胞质内脂褐素颗粒较多，另外可见高尔基复合体囊泡肿胀；党参低剂量组小鼠皮肤成纤维细胞核染色较深，粗面内质网轻度扩张，可见少量空泡化的线粒体，脂褐素颗粒增多；党参中、高剂量组中小鼠皮肤成纤维细胞结构较为完整，粗面内质网扩张不明显或无扩张，脂褐素颗粒较少。

2.4 计算生物学预测党参抗皮肤衰老的靶点及相关通路

GSE181022基因芯片原始数据经过归一化处理后，获得差异表达基因687个，其中348个上调基因和339个下调基因（见图5-A);GSE107361基因芯片数据分析后，获得差异表达基因3471个，其中2431个上调基因和1040个下调基因（见图5-B）。TCMSP数据库分析得到党参活性成分17个，其中9个成分[木犀草素、川穹哚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、果胶A、3-β-羟甲基丹参醌、7-(β-木糖基）三杉尖宁碱、曼陀罗灵醇、大豆黄素、11-羟基兰金断肠草碱]为水溶性，8个成分﹛豆甾醇、7,22E-二烯-3β-醇、邻苯二甲酸二异辛酯、内酯类、菠菜甾醇、豆甾-7-烯醇、甲基-11,14-二烯酸酯、（8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-基]-10,13-二甲基-1,2,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢环戊烷[a]菲-3-酮﹜为脂溶性。除去重复靶点，共有102个党参药物靶点，将其与上述芯片结果取交集后共得到4个核心靶点（见图5-C）。通过STRING数据库及Cytoscape 3.9.0对核心靶点进行蛋白互作分析，并根据各基因靶点度值（degree）评价核心靶点，结果发现MMP9度值最高，处在几个靶点互作的核心位置，见图5-D。

图4 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织细胞超微结构的影响（透射电镜，×6 000)

图5 皮肤老化组织芯片差异表达基因的计算生物学分析

2.5党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织MMP9分子的表达调控作用

结果见图6-A。与正常对照组相比，MMP9 mRNA在衰老模型组小鼠皮肤组织中表达上调，党参干预后，MMP9mRNA表达显著降低（P<0.05）。用Western Blot法检测MMP9在各组皮肤组织的蛋白表达，发现衰老模型组MMP9蛋白的表达上调，随着党参干预剂量的增加，MMP9蛋白表达量减少，其中中、高剂量组有统计学意义（P<0.05）。见图6-B和图6-C。

2.6党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织中NF-κB通路主要蛋白表达的影响

Western Blot法检测各组小鼠皮肤组织中NF-κB通路主要蛋白的表达水平，结果发现IκBα、IKKα、NF-κB P65蛋白在衰老模型组中表达增加（P<0.05），在党参干预后表达下调，且随着党参干预剂量的增加，IκBα、IKKα、NF-κB P65蛋白表达量逐渐减少（P<0.05）。见图7-A和图7-B。

3、讨论

已有研究[16]显示，党参水提物可显著增强体质，提高免疫力，并能有效延缓衰老过程。本研究结果表明，党参干预后小鼠皮肤组织胶原纤维排列整齐，结构损伤有明显改善，皮肤成纤维细胞结构趋于完整，证实了党参水提物对皮肤组织结构有保护作用。SOD能特异性清除体内氧自由基，随着年龄的增长，体内SOD活性降低会导致氧自由基堆积加速机体衰老[17];MDA是极其活泼的交联剂，在自由基氧化细胞内，MDA可使真皮结构发生交联，纤维紊乱、增粗，引起皮肤老化表型[18];HYP是胶原蛋白的成分之一，胶原蛋白减少可导致支撑皮肤的胶原肽链和弹力网断裂，使皮肤组织出现萎缩、干燥、皱纹、松弛、无弹性等老化现象[19]。本研究证实，党参水提物能提高衰老模型皮肤组织中SOD的活性和HYP的含量，抑制MDA的含量，减少有害产物对皮肤的损害，提高皮肤的抗氧化能力，使小鼠皮肤胶原蛋白含量增加，维持皮肤弹性，从而延缓皮肤老化。

图6 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织MMP9基因和蛋白表达的作用（±s,n=3)

图7 党参水提物对衰老模型小鼠皮肤组织NF-κB通路的调控

基于数据库和各类算法的计算生物学分析已广泛应用于生物医学研究，可辅助发现疾病新的生物标志物、筛选新药物、预测干预靶点[20-21]。本研究通过从GEO数据库提取人的老化皮肤组织芯片数据，应用R语言和中药数据库进行分析，既分析了党参有效成分对应的分子靶点，又构建了核心分子之间的分子网络，为揭示党参干预皮肤老化的分子机制提供了依据，也为党参抗衰老作用提供了物质基础。在分析得到的4个靶基因中，MMP9与其他分子都有交联，处于核心位置，是党参主要成分黄酮类木犀草素的作用靶点[22]。MMP9是基质金属蛋白酶超家族明胶酶亚组的成员，其主要功能是降解和重塑细胞外基质，调控其动态平衡，消化皮肤基底膜的重要组成部分Ⅳ型胶原蛋白[23]；并可以降解MMP1的降解产物，导致皮肤胶原蛋白流失，继而加速皮肤衰老[24-25]。据报道[26-28],MMP9基因的表达受到NF-κB信号通路调控，人体衰老后皮肤中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）浓度异常会激活NF-κB信号通路，IκBα、IKKα、NF-κB P65蛋白都是NF-κB信号通路传导中的重要分子，当IκB激酶被细胞外刺激激活时，可催化NF-κB的抑制蛋白IκB特异位点的磷酸化，介导NF-κB的入核和基因转录的调控。与衰老模型组相比，党参干预后MMP9及其所在的NF-κB通路主要分子的mRNA和蛋白水平的表达趋势均有所下降。研究[29]表明，NF-κB信号通路调控MMP9的表达过程中存在磷酸化，因此推测其蛋白水平的表达与该过程的磷酸化有关。因此本研究通过对党参干预后皮肤组织中MMP9及其所在NF-κB主要蛋白表达的检测，证明了MMP9是党参干预皮肤老化组织的靶点分子，并且NF-κB通路与该过程密切相关。

综上所述，党参水提物可以有效减轻衰老模型小鼠皮肤组织的老化，通过抑制NF-κB通路中IκBα、IKKα、NF-κB P65蛋白的表达，减少下游基因MMP9的表达，从而减轻皮肤胶原破坏，抵抗皮肤老化，为党参抗皮肤老化的作用机制提供了科研依据。

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基金资助:国家自然科学基金项目(82060829); 甘肃省自然科学基金(23JRRA1720); 甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室开放基金(LDSWZY2002-3); 甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室项目(zzy-2024-06); 2023年甘肃中医药大学研究生创新创业基金(2023CX);

文章来源:王振娟,柳立军,安琪,等.基于计算生物学和动物实验探究党参抗皮肤衰老的作用机制[J].中药新药与临床药理,2024,35(08):1107-1114.