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酪酸梭菌对NAFLD小鼠肠黏膜通透性的影响及相关机制

2024-10-14 79 上传者：管理员

摘要：目的探讨酪酸梭菌(CB)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肠黏膜通透性的影响及相关机制。方法使用高脂饮食构建NAFLD小鼠模型，将小鼠分为模型组(Mod)、酪酸梭菌低剂量组(CBL,0.5×10～7 CFU/mL)、酪酸梭菌高剂量组(CBH,1.0×10～7 CFU/mL),同时设置正常对照组(Con),每组8只，每周记录1次小鼠体质量。末次给药完成后小鼠禁食12 h,心脏取血，取肝脏组织、小肠组织，应用酶联免疫吸附法检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、二胺氧化酶(DAO)水平和肝脏组织IL-6、TNF-α水平；苏木精-伊红染色观察肝脏组织病理变化；Western blot检测小肠组织中紧密连接蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)蛋白表达。结果随着培养时间的延长，各组小鼠体质量均呈增长趋势，培养第4周开始，Mod小鼠体质量明显高于Con小鼠，CBL、CBH小鼠体质量较Mod小鼠均有降低(均P<0.05),CBH小鼠体质量下降幅度更为明显。Mod小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明显高于Con小鼠(P<0.01);CBL、CBH小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明显低于Mod小鼠(P<0.05),CBH小鼠下降幅度更明显。苏木精-伊红染色显示，CBL、CBH小鼠肝组织中纤维结构和肝小叶结构较Mod小鼠明显改善，脂肪沉积、细胞变性和坏死、炎症细胞浸润也明显减轻。Mod小鼠血清DAO水平及肝组织中IL-6、TNF-α水平明显高于Con小鼠(P<0.01);CBL、CBH小鼠血清DAO水平及肝组织中IL-6、TNF-α水平明显低于Mod小鼠，CBH小鼠明显低于CBL小鼠(均P<0.05)。Mod小鼠小肠组织中Occludin表达水平、ZO-1蛋白表达水平明显低于Con组小鼠(P<0.01);CBL、CBH小鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达水平明显高于Mod小鼠，CBH小鼠明显高于CBL小鼠(均P<0.05)。结论 NAFLD小鼠肠黏膜屏障受损可导致纤维结构和肝小叶结构破坏，紧密连接表达减少，CB可通过上调Occludin、ZO-1蛋白表达增强紧密连接，进而改善肠黏膜通透性。

关键词：
CB
NAFLD
肠黏膜通透性
酪酸梭菌
非酒精性脂肪性肝病
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目前，我国非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率不断上升。NAFLD可导致肝硬化、肝细胞癌和心血管疾病，对患者的生活质量和预期寿命产生负面影响[1]。流行病学研究[2]显示，NAFLD与肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征密切相关，会增加患病风险；NAFLD在男性、经济发展水平较高地区更为常见，且随着年龄的增加患病率逐渐升高[3],因此，有效预防和管理NAFLD尤为重要，包括生活方式改变、饮食调整、体质量控制及治疗相关代谢疾病等。肠黏膜通透性增强可能在NAFLD发病机制中发挥作用。研究[4]表明，肠黏膜通透性增强可导致肠道内细菌和其代谢产物进入肝脏，刺激肝脏产生炎症反应，进而促进NAFLD发展。益生菌具有调节肝脏代谢、抑制肝脏炎症、调节肠道菌群、预防肥胖等作用[5],在NAFLD治疗中发挥了一定作用，但不同类型益生菌的作用存在差异。目前，关于酪酸梭菌(CB)对NAFLD疗效的研究较少，本研究主要探讨CB对NAFLD小鼠肠黏膜通透性的影响及相关机制。

1、材料与方法

1.1 动物与主要试剂

32只雄性C57BL/6J小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司，许可证编号：SCXK(苏)2023-0009),8周龄，体质量(20±2)g, 适应性喂养1周后进行试验。CB,青岛东海药业有限公司；高脂饲料，江苏省协同医药生物工程有限责任公司；血清指标酶联免疫吸附检测试剂盒，西格(上海)生物科技有限公司；肝组织炎症指标酶联免疫吸附检测试剂盒，博研(南京)生物科技有限公司；小肠组织中紧密连接蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)蛋白表达Western blot检测一抗及对应的二抗，优宁维(上海)生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立与分组

使用高脂饮食构建NAFLD小鼠模型，高脂饮食配方：猪油、秘鲁鱼粉、美国鸡肉粉、玉米、氨基酸、复合维生素、复合微量元素等。将小鼠分为模型组(Mod)、酪酸梭菌低剂量组(CBL)、酪酸梭菌高剂量组(CBH),同时设置正常对照组(Con),每组8只。Mod、CBL、CBH小鼠喂高脂饲料，Con小鼠喂普通饲料，连续8周。培养8周造模成功后，次日起CBL、CBH小鼠分别灌胃给予0.5×107CFU/mL、 1.0×107CFU/mL酪酸梭菌，Mod和Con小鼠灌胃给予等量生理盐水，0.2 mL/次，1次/d, 连续6周。每周记录1次各组小鼠体质量。

1.2.2 血清指标检测

末次给药完成后，小鼠禁食12 h, 腹腔注射5%水合氯醛对小鼠进行麻醉；心脏取血，离心收集血清，按酶联免疫吸附法检测试剂盒说明进行稀释；将标准品和样本加到预先包被有固相抗原的微孔板中，孵育后用洗涤液洗涤微孔板3次，除去未结合的物质；向微孔板中添加酶标记抗体，孵育后洗涤，以去除未结合的酶标记抗体；向微孔板中添加底物，孵育后加入终止剂，终止酶促反应；使用酶标仪测定每个微孔的吸光度，根据标准曲线计算小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、二胺氧化酶(DAO)水平。

1.2.3 肝组织苏木精-伊红染色及IL-6、TNF-α水平检测

取小鼠肝脏组织，分成两部分，一部分用于苏木精-伊红染色，另一部分用于组织匀浆。使用固定剂处理肝脏组织后洗涤，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm切片，置于载玻片上，在加热平台中将肝脏组织与载玻片更好地结合，进行苏木精-伊红染色，使用光学显微镜观察和评估染色的肝脏组织；应用酶联免疫吸附法检测IL-6、TNF-α水平。

1.2.4 Western blot检测小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达

取小鼠小肠组织，使用蛋白提取试剂提取小肠组织蛋白，离心收集上清液，BCA法测定蛋白浓度；电泳后，使用电转法将目标蛋白转移至PVDF膜，室温封闭1 h; 滴加兔抗人Occludin单克隆抗体(1:1 000稀释)、兔抗人ZO-1单克隆抗体(1:800稀释)、兔抗人β-actin单克隆抗体(1:2 000稀释),4 ℃冷藏过夜；次日滴加二抗，稀释倍数为1:4 000,室温静置1 h, ECL显影，使用Image J软件读取条带的灰度值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0对数据进行处理与统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差

表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠体质量

经重复测量设计资料的方差分析(ANOVA)显示，随着培养时间的延长，各组小鼠体质量均呈增长趋势。培养第4周开始Mod小鼠体质量明显高于Con小鼠(F=9.053,P<0.05);培养至第14周，CBL、CBH小鼠体质量明显低于Mod小鼠，CBH小鼠体质量下降幅度更明显(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠体质量

2.2 各组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平

本研究结果显示，Mod小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明显高于Con小鼠(P<0.01);CBL、CBH小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明显低于Mod小鼠，CBH小鼠下降幅度更明显(P<0.05),见表2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平

2.3 各组小鼠肝脏病理变化

本研究结果显示，Con小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞内只有少量脂肪，无细胞变性和坏死、炎症细胞浸润以肝脏纤维化。Mod小鼠肝组织中纤维结构增多和肝小叶结构破坏；肝细胞内脂肪沉积增加，脂肪滴呈圆形或椭圆形，位于细胞质内；部分肝细胞出现变性和坏死现象，肝组织中可见炎症细胞浸润。CBL、CBH小鼠肝组织中纤维结构和肝小叶结构较Mod小鼠明显改善，脂肪沉积、细胞变性和坏死、炎症细胞浸润也明显减轻，见图1。

图1 各组小鼠肝脏病理变化(n=8,HE,×200)

2.4 各组小鼠血清DAO水平及肝组织中IL-6、TNF-α水平

本研究结果显示，Mod小鼠血清DAO水平及肝组织中IL-6、TNF-α水平明显高于Con小鼠(P<0.01);CBL、CBH小鼠血清DAO水平及肝组织中IL-6、TNF-α水平明显低于Mod小鼠，CBH明显低于CBL(P<0.05),见表3。

表3 各组小鼠血清DAO水平及肝组织中IL-6、TNF-α水平

2.5 各组小鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达

本研究结果显示，Mod小鼠小肠组织中Occludin表达水平、ZO-1蛋白表达水平明显低于Con(P<0.01);CBL、CBH小鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达水平明显高于Mod, CBH明显高于CBL(P<0.05),见图2、表4。

图2 各组小鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达

表4 各组小鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达

3、讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指肝脏内脂肪含量超过正常水平但不伴饮酒过量的肝病。近年来研究[6]发现，益生菌对NAFLD具有改善作用，可能通过减少肠道炎症反应、产生IL-10等抗炎物质而减轻肝脏炎症程度，还能够增加自然杀伤细胞的数量和活性，增强免疫力，应对肝脏内的细胞损伤；益生菌可通过调节肠道微生物群落，影响代谢物的吸收和排放，进一步影响肝脏健康[7]。但目前关于益生菌在NAFLD中作用的研究结果尚不一致，不同种类益生菌预防和治疗作用的研究结果存在差异。酪酸梭菌(CB)通过增加肠道上皮屏障的完整性减少有害菌增殖，并促进巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞活化，以增强肠道抵抗力[8-9]。此外，CB具有生长速度快、竞争力强的特点，通过占据肠道的生境和养分抑制病原菌生长，进而减少对肠道健康的不利影响[10];CB还具有调节肠道蠕动和水分吸收等机制，促进肠道正常运动和提高消化吸收功能，有助于改善便秘和腹泻等肠道问题[11]。但关于CB对NAFLD的改善作用和相关机制研究仍十分少见。

本研究结果显示，Mod小鼠体质量明显高于Con小鼠(P<0.01),CBL、CBH小鼠体质量低于Mod小鼠(P<0.05);Mod小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明显高于Con小鼠，CBL、CBH小鼠明显低于Mod小鼠(P<0.05),提示NAFLD小鼠体质量、肝功能指标和血脂指标均明显增加、提高；ALT和AST主要存在于肝细胞中，非酒精性脂肪性肝病的特征性表现为肝细胞损伤，血清ALT和AST水平能够反映肝细胞的损伤程度[12]。TC和TG是血脂组成部分，血脂异常是非酒精性脂肪性肝病的重要影响因素之一，可能损伤血管内皮，进而引发脂肪肝[13]。CB能够有效改善上述指标，且高剂量改善效果较低剂量更明显。DAO是一种能够催化丁酸盐氧化反应的酶，其活性水平与肠黏膜通透性密切相关[14]。本研究中，Mod小鼠血清DAO水平明显高于Con小鼠(P<0.01),CBL、CBH小鼠明显低于Mod小鼠(P<0.05)。肠黏膜通透性增强时，肠道内的细菌和代谢产物可以进入血液循环系统，DAO水平可能会升高[15];结合本研究结果可知，CB能够有效改善NAFLD小鼠肠黏膜通透性。在NAFLD进展中，肠黏膜通透性增强，导致肠道内细菌和内毒素进入肝脏，刺激肝脏产生炎症反应[16]。IL-6、TNF-α是炎症反应的重要标志物，其中IL-6可以促进脂肪沉积和炎症反应，而TNF-α能够诱导肝脏炎症反应[17]。本研究中，Mod小鼠肝组织中IL-6、TNF-α水平明显高于Con小鼠，CBL、CBH小鼠明显低于Mod小鼠(均P<0.05),提示CB能够降低NAFLD肝组织炎症反应，有助于改善病情。

紧密连接是细胞间隙的一种结构，负责调控细胞旁路通路的物质交换，维持细胞极性，并参与信号转导[18]。Occludin蛋白、ZO-1蛋白是两种重要的紧密连接蛋白，在细胞极性、细胞间屏障功能及物质选择性通透中发挥重要作用。其中，Occludin是一种20 kD的跨膜蛋白，在细胞膜上形成孔道，允许水分和小分子通过，同时限制大分子带电粒子通过，在调节细胞间通透性方面起到分子滤网作用，能够保持细胞内外环境稳定[19];ZO-1蛋白是一种更大的蛋白质，为220 kD的肌动蛋白结合蛋白家族，作为一种支架蛋白能够连接细胞膜上的紧密连接蛋白，同时与细胞骨架相连，维持紧密连接的稳定性和调节细胞间通透性[20]。本研究中，Mod小鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达水平明显低于Con小鼠，CBL、CBH小鼠明显高于Mod小鼠，CBH小鼠明显高于CBL(均P<0.05),提示NAFLD小鼠肠黏膜屏障受损，导致紧密连接表达减少，CB可通过上调Occludin、ZO-1蛋白表达而增强紧密连接，进而改善肠黏膜通透性。

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