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安石榴苷在模拟人体胃肠道环境及生物样品中的稳定性考察

2023-08-23 128 上传者：管理员

摘要：目的考察安石榴苷在不同生理pH介质和生物样品中的体外稳定性。方法安石榴苷在不同生理pH介质(pH 1.2、pH 6.8、pH 7.4)的缓冲溶液、人工胃液、人工肠液和离体生物介质中进行孵育，利用HPLC测定安石榴苷的含量变化，考察安石榴苷的降解情况及酶稳定性。结果安石榴苷在pH 1.2、人工胃液、胃内容物中8 h内基本稳定，降解率<5%,在pH 6.8、pH 7.4,小肠内容物、大肠内容物中发生明显降解，8 h内降解率分别为40.50%、56.86%、60.41%、81.45%;在肝匀浆液中降解较快，到8 h时已测不到安石榴苷。结论安石榴苷在酸性环境中基本稳定，在碱性环境中易降解；在大鼠胃内容物中较稳定，在小肠、大肠菌群及肝匀浆液中易降解。

关键词：
人工胃肠液
安石榴苷
生物样品
稳定性
胃肠道
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石榴皮是石榴科植物石榴(Punicagranatum L.)的干燥果皮，主要的化合成分有鞣质类(含量高达25%～30%)、类黄酮及原花青素类，其中安石榴苷是一种可水解的单宁，是石榴皮中特异性成分[1],含量在10%左右[2]。研究表明，安石榴苷具有良好的抗炎、抗氧化[3]、降血脂[4]等多种药理作用。安石榴苷在体内外药理活性方面研究报道较多，但在胃肠道内的稳定性的研究较少。本实验通过考察安石榴苷在模拟胃肠道环境及生物样品中的稳定性研究，阐明影响安石榴苷体内稳定性的因素，为安石榴苷在体内过程研究提供实验数据，为剂型选择和生物利用度改善提供依据。

1、材料与方法

1材料

动物雄性SD大鼠，SPF级，体质量180～220 g,由新疆医科大学实验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK(新)2021-0021。本实验经新疆医科大学实验动物伦理委员会批准，伦理审批号：IACUC-20220314-16。

药品与试剂安石榴苷对照品，规格：每瓶20 mg,纯度：98.82%,批号：MUST-21050502,购自成都曼斯特生物科技有限公司；三氟乙酸，购自上海麦克林生化科技有限公司；胃蛋白酶，购自德国Biofroxx生化试剂公司；胰蛋白酶，购自Solarbio北京索莱宝科技有限公司；甲醇，色谱纯，购自美国Sigma-Aldrich公司；磷酸二氢钾，购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，购自天津市北联精细化学品开发有限公司。

仪器Ultimate 3000高相液相色谱仪，美国Thermo Scientific公司产品；LD5-2A低速离心机，北京医用离心机厂产品；H1-16KR台式高速冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司产品；AB-135S电子分析天平，瑞士梅特勒公司产品。

2、实验方法与样本采集

健康雄性SD大鼠禁食不禁水12 h以上，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血处死，迅速取出胃、小肠、大肠和肝。用适量冰冷的0.9%NaCl冲洗表面浮血，用滤纸吸干表面的水分，收集胃、小肠和大肠内容物，按质量体积比1∶4(mg∶mL)分别加入冰冷的pH 1.2、pH 6.8、pH 7.4磷酸盐缓冲液，涡旋10 min,充分混匀，将上述内容物在4℃下以4 000 r·min-1离心15 min,取上清液备用。所有操作均在冰浴上进行，临用前新鲜配制。

3、色谱条件、溶液配制与样品处理

色谱条件[7] Agilent SB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm, 5μm);流动相A:甲醇，流动相B:0.1%三氟乙酸；梯度洗脱条件为0～15 min, 3%～20% A;15～25 min, 20%～45% A;25～35 min, 45%～80% A;流速：1.0 mL·min-1;柱温：30℃;检测波长：370 nm;进样量：10μL。

样品处理取孵育样品200μL,加入甲醇500μL,涡旋2 min,在4℃下以12 000 r·min-1离心10 min,取上清液过0.22μm微孔滤膜，HPLC测定分析。

人工胃液[8]取稀盐酸16.4 mL,加水约800 mL与胃蛋白酶10 g,摇匀后，加水稀释至1 000 mL,即得胃蛋白酶浓度为10 mg·mL-1。

人工肠液[9]取磷酸二氢钾6.8 g,加水500 mL溶解，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10 g,加水适量溶解，将2种溶液混合后，加水稀释至1 000 mL,即得胰酶浓度为10 mg·mL-1。

4、方法学考察

专属性考察分别对空白人工胃液、空白人工肠液、空白大鼠胃内容物、空白大鼠小肠内容物、空白大鼠大肠内容物、空白肝组织匀浆液、空白pH 1.2溶液、空白pH 6.8溶液、空白pH 7.4溶液，按“样品处理”项下方法操作，取样进行色谱分析，记录色谱图。

标准曲线与定量下限精密称取安石榴苷适量，用蒸馏水溶解，配成520μg·mL-1储备液，备用。从储备液中吸取适量溶液，用蒸馏水稀释，配制系列浓度为8.12、16.25、32.5、65、130、260、520μg·mL-1的对照品溶液，按色谱条件测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。以信噪比为10,计算定量下限。

精密度与回收率取低、中、高质量浓度的安石榴苷对照品溶液(32.5、130、260μg·mL-1)按色谱条件重复进样6针，测定日内精密度和连续进样3 d,测定日间精密度。精密吸取9份样品(130μg·mL-1安石榴苷)500μL,分别加入安石榴苷对照品溶液(260、130、65μg·mL-1)500μL,按色谱条件测定，计算平均回收率。

5、方法学应用

安石榴苷在不同生理pH缓冲液中稳定性研究精密吸取安石榴苷储备液5 mL至50 mL容量瓶中，分别用已预热至37℃的pH 1.2、pH 6.8、pH 7.4缓冲溶液定容至刻度，摇匀，分别装在6个具塞试管中，将试管置于37℃恒温水浴中孵育，分别于0、1、2、4、6、8 h定时取出试管，按“样品处理”方法处理，HPLC测定安石榴苷含量。

安石榴苷在人工胃液、肠液中的稳定性研究精密吸取安石榴苷储备液5 mL至50 mL容量瓶中，分别用已预热至37℃的人工胃液、人工肠液定容至刻度，摇匀，分别装在6个具塞试管中，将试管置于37℃恒温水浴中孵育，分别于0、1、2、4、6、8 h定时取出试管，按“样品处理”方法处理，HPLC测定安石榴苷含量。

安石榴苷在大鼠离体生物样品中的稳定性研究精密吸取安石榴苷储备液5 mL至50 mL容量瓶中，分别用已预热至37℃的胃内容物、小肠内容物、大肠内容物和肝匀浆液定容至刻度，摇匀，分别装在6个具塞试管中，将试管置于37℃恒温水浴中孵育，分别于0、1、2、4、6、8 h定时取出试管，按“样品处理”方法处理，HPLC测定安石榴苷含量。

6、结果

1方法学评价

专属性在上述条件下，安石榴苷的保留时间为14.25 min和17.93 min,峰形良好，杂质峰对样品测定均无干扰，结果表明各生物介质不影响安石榴苷的测定结果，见图1。

图1高效液相色谱图

标准曲线与定量下限安石榴苷标准曲线方程为y=109.57x-1 806.61(R2=0.999 4),在8.12～520μg·mL-1线性关系良好，最低定量下限为8.12μg·mL-1(信噪比>10)。

精密度与回收率安石榴苷定量下限及低、中、高质量浓度质控样品的日内、日间精密度RSD均小于3.0%,测得安石榴苷的提取回收率均大于85%,结果见表1。

2方法学应用

2.1安石榴苷在不同生理pH缓冲液中稳定性研究

降解曲线见图2。结果发现安石榴苷随pH升高降解速率明显加快，经零级或一级速率方程模拟降解过程表现为一级动力学过程，其降解常数及半衰期见表2。

安石榴苷在37℃水浴孵育8 h,当pH 1.2时相对稳定，降解率<5%,而在其它不同pH磷酸缓冲溶液中，降解率分别为40.50%、56.86%,安石榴苷在不同pH溶液中降解速率快慢顺序为pH 7.4磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)>pH 6.8 PBS>pH 1.2盐酸。表明安石榴苷呈现pH依赖性，随着pH的逐渐升高，安石榴苷降解速率逐渐加快。表明安石榴苷在pH 1.2溶液中8 h内稳定，而在pH 6.8及pH 7.4缓冲溶液中不稳定。

2.2安石榴苷在人工胃液、肠液中的稳定性研究

计算安石榴苷在不同时间点的剩余率，结果表明，8 h内安石榴苷在人工胃液中相对稳定，降解率<5%,表明胃蛋白酶可能对安石榴苷稳定性影响较小；安石榴苷在人工肠液中降解随时间的延长降解速率明显升高，与pH 6.8磷酸缓冲液比较，安石榴苷降解略有增快，说明胰蛋白酶对安石榴苷稳定性有一定的影响。降解曲线见图3。经零级或一级速率方程模拟降解过程表现为一级动力学过程，见表2。表明安石榴苷在人工胃液8 h内稳定，而在人工肠液中不稳定。

图2安石榴苷在不同pH溶液中的降解曲线(n=3)

图3安石榴苷在不同生物样品中的降解曲线(n=3)

2.3安石榴苷在大鼠离体生物样品中的稳定性研究

计算安石榴苷在不同时间点的剩余率，结果表明，安石榴苷在大鼠离体胃、小肠、大肠等不同部位降解存在差异，安石榴苷在胃内容物中剩余率>95%,表明安石榴苷在胃中相对较稳定，胃蛋白酶对安石榴苷影响不大。安石榴苷在小肠内容物和大肠内容物中降解情况相似，降解较快，8 h后安石榴苷在大肠、小肠内容物中降解率分别是81.45%和60.41%。安石榴苷在肝匀浆液中降解较快，6 h时，安石榴苷剩余率<20%,到8 h时已测不到剩余安石榴苷，降解曲线见图3。经零级或一级速率方程模拟降解过程表现为一级动力学过程，见表2。从降解曲线可以看出肠道菌群、肠内微生物或肠道内的酶对安石榴苷稳定性影响较大，而胃蛋白酶对其没有显著影响。表明安石榴苷在胃内容物8 h内稳定，而在小肠内容物、大肠内容物及肝匀浆液中不稳定。

7、讨论

口服药物必须经过体内过程(吸收、分布、代谢、排泄)才能发挥药效[10],一般吸收的主要部位在胃和小肠，关于安石榴苷在胃肠液稳定性及体内过程研究报道较少。因此，本文最大程度模拟药物进入体内后在消化道内的运行情况，可以阐明安石榴苷在体内处置过程影响其代谢、降解的主要因素[11]。

从化学结构分析，安石榴苷中含有多个酚羟基，因此在碱性环境中易发生降解。研究中也发现安石榴苷在胃液环境中几乎不发生降解，然而在肠液及肝匀浆液中不稳定，出现新的物质，有待进一步深入研究，推测安石榴苷主要受胃肠道酸碱环境的影响，能够在酸性环境中稳定存在。安石榴苷在肠液及肝匀浆液中浓度明显降低，出现的新物质是否是随着pH的升高而出现结构的变化，是否受到肝匀浆液、肠道菌群及酶的影响还需要进一步的研究证实，同时降解产物也需要进一步的鉴定。

药物在胃肠道环境下的稳定性测定是药物发现和开发过程中必要的研究步骤，特别是口服药物在胃肠道的稳定性，将会直接影响到药物在胃肠道吸收进入血液循环的有效性[12]。有研究报道安石榴苷在体内生物利用度较低[13],从研究结果来看，其体外模拟胃肠道环境中，安石榴苷是不稳定的化合物，易受pH、胰蛋白酶的影响，其代谢可能受肠道菌群和肠内微生物或肠道酶等环境的影响较大，这可能是造成其生物利用度低的因素之一。通过本实验的研究可以为安石榴苷药物的开发利用提供一定的参考价值。

参考文献:

[1]张杰,崔艳娜,刘绣华.安石榴苷的研究进展[J]化学研究, 2014.25(6):551-562.

[2]朱静石榴皮中生物活性成分的提取纯化[D].北京:北京化工大学, 2009.

[3]梁俊,李建科,刘永峰,等石榴皮多酚对脂变L -02肝细胞HMG-C0A还原酶mRNA表达的影响[J].食品与生物技术学报, 2013,32(9):957-961.

[4]刘艳平,余自成知母皂苷BII在模拟人体胃肠道环境及生物样品中的稳定性研究[J]中国现代应用药学, 2018,35(5):653-656.

[5]张庆白果止咳化合物GK-A的药代动力学研究[D].北京:中国中医科学院, 2020 .

[6]牛若患,常占瑛,热娜吉恩斯,等.石榴皮提取液中安石榴苷的稳定性研究[J].中国食品添加剂, 2022,33(6):95-101.

[7] Ch.P (2020) Vol IV中国药典2020版[S]四部.2020:462-463.

文章来源:常占瑛,牛若惠,热娜·吉恩斯,王梅,李云艳,高晓黎.安石榴苷在模拟人体胃肠道环境及生物样品中的稳定性考察[J].中国临床药理学杂志,2023,39(16):2388-2392.

基金资助:新疆维吾尔自治区重大专项基金资助项目(2022A03019-3);省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题资助项目(SKL-HIDCA-2022-13);