无创产前检测(NIPT)通过在妊娠早期对母体外周血游离的胎儿DNA进行全基因组平行测序，筛查胎儿常见染色体非整倍体21、18、13-三体综合征为目标疾病，其特异度和灵敏度均高达99%,目前作为一线的产前筛查技术已广泛应用于临床[1-2]。临床上对于NIPT 提示高风险的孕妇一般采取介入性产前诊断染色体核型分析和基因拷贝数变异(CNV)分析进行验证，但是常规G显带核型分析检测水平有限，不能检测小于10 Mb的染色体异常，而CNV分析可以对CNV进行高分辨率检测，但不能有效检测出基因组平衡的染色体易位及倒位等异常，故临床上多采用不同基因检测方法进行联合诊断，以提高检测的准确性[3]。目前，除目标疾病外，NIPT还可以发现性染色体非整倍体、其他罕见染色体非整倍体(RAT)和微缺失/重复，部分研究数据表明其也具有较高的特异度和灵敏度，但需要积累足够的临床数据及进一步的产前诊断验证[4-5]。9号染色体异常是NIPT筛查出RAT和微缺失/重复中比较常见的类型之一，9号染色体异常可能会导致胎儿多系统发育迟滞、特殊面容等，其产前筛查和产前诊断报道较少。本研究回顾性分析16例经NIPT提示为9号染色体异常孕妇的资料，以探讨NIPT在筛查胎儿9号染色体非整倍体异常和微缺失/重复中的临床价值，为遗传咨询和临床诊断提供参考。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年8月至2023年12月就诊于首都医科大学附属北京妇产医院产前诊断中心且NIPT提示为9号染色体异常的16例孕妇作为研究对象，年龄27～41岁，平均(32.79±4.27)岁，孕周13+5～19+2周，平均(16.42±1.81)周，单胎，初产妇，均为自然受孕。参照中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》[6],其筛查指征分别为：高龄妊娠(预产期年龄≥35岁)9例，血清学筛查临界风险1例，B超软指标异常/结构异常1例，自愿要求4例，其他不良孕产史1例。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。本研究通过首都医科大学附属北京妇产医院医学伦理学委员会审核批准(2019-KY-046-01)。

1.2 方法

1.2.1 NIPT

采用乙二胺四乙酸二钾抗凝试管采集所有孕妇外周静脉血5mL,4 ℃ 2 820 r/min离心10 min后分离血浆；再4 ℃ 13 053 r/min离心10 min, 取上清液为血浆标本置于-80 ℃冰箱中保存备检。采用BGISEQ-500高通量测序仪及武汉华大智造科技有限公司提供的配套试剂进行测序。将测序获得的原始数据与人类参考基因组GRCh37/hg19版本进行比对和生物信息学分析。

1.2.2 G显带染色体核型分析

在超声连续引导定位无菌条件下，通过羊膜腔穿刺抽取孕妇20 mL羊水标本进行双线细胞接种、双线培养，收获细胞并制备染色体玻片，进行G显带染色，在400条带水平分析染色体核型。每例至少计数20个染色体核型，分析5个核型，如遇异常加大计数。根据人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2020)分析染色体核型。

1.2.3 CNV分析

提取羊水细胞基因组DNA,取10 ng DNA采用“快速PCR-free文库构建技术”,经过酶切、修复等进行文库构建，采用NextSeq CN500基因测序仪进行测序。参考人类基因组GRCh37/hg19版本，测序结果利用科诺安数据分析软件(杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司)进行分析比对，根据检测值判断对应染色体检测区域的检测结果为单倍体、二倍体、多倍体或嵌合等。参考DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC和PubMed等国际公共数据库及美国医学遗传学与基因组学会(ACMG)相关建议[7]对CNV结果解读和评判。

1.3 病例资料收集

回顾性整理入组孕妇的一般信息资料，收集孕妇NIPT结果、染色体核型分析结果、CNV结果及其异常片段情况和妊娠结局，随访活产儿情况。

2、结果

2.1 NIPT、染色体核型分析和CNV分析结果

本研究纳入的16例NIPT提示9号染色体异常的孕妇中，其中2例孕妇拒绝产前诊断随访观察，14例孕妇知情同意后接受进一步介入性产前诊断，产前诊断结果中有5例9号染色体核型分析和(或)CNV分析结果异常，包括3例嵌合型9-三体综合征，1例致病性CNV,1例临床意义未明CNV,NIPT阳性预测值为35.71%(5/14),见表1。其中病例2、6和7进行NIPT均提示为9号染色体数目增多，经介入性产前诊断均为嵌合型9-三体综合征，其嵌合比例为9%～60%;病例11经NIPT提示为9号染色体p21.3-p24.3区域重复22.7 Mb, 经CNV分析诊断为9号染色体p21.3-p24.3区域重复23.22 Mb, 14号染色体q11.2区域重复4.56 Mb, 均为致病性CNV,同时胎儿染色体核型分析结果为47,XN,+der(14)t(9;14)(p22;q11.2),并对其父母进行染色体核型分析，发现其父母一方正常，另一方外周血染色体核型G显带结果为46,XN,t(9;14)(p22;q11.2);病例10经NIPT提示为9号染色体q12-q21.13重复9.82 Mb, 经介入性产前诊断羊水细胞染色体核型为未见异常，CNV结果为9号染色体q21.11-q21.13重复3.82 Mb, 经判断为临床意义未明CNV;病例4诊断为其他染色体平衡易位；病例7、11结果见图1、2。病例3、4、8、9、12、13、14和15经NIPT均提示为9号染色体数目增多或微缺失/重复，染色体核型分析和(或)CNV分析结果均为未见异常。

2.2 NIPT提示异常病例的妊娠结局

14例接受介入性产前诊断孕妇中6例NIPT提示异常孕妇均进行产前诊断，其中3例产前诊断结果为嵌合型9-三体综合征，其嵌合比例为9%～60%,孕妇随诊B超均提示胎儿出现不同程度的异常，均选择终止妊娠；1例结果为致病性CNV,孕妇经遗传咨询后选择终止妊娠；1例结果为临床意义未明CNV,孕妇遗传咨询后建议随诊，并足月分娩，新生儿未见异常；1例诊断为其他染色体的平衡易位，孕妇足月分娩，新生儿未见异常；其余8例NIPT提示异常孕妇产前诊断结果均未见异常，正常足月分娩，其新生儿生长发育未见异常。另外2例NIPT提示异常孕妇拒绝产前诊断后随诊观察，1例于孕16周胎死宫内；1例足月分娩，新生儿多发畸形，表现为腭裂、尿道下裂及双侧隐睾等症状。见表1。

表1 16例NIPT提示9号染色体异常的相关检测结果

图1病例7的NIPT、CNV及染色体核型分析检测结果

图2病例11的NIPT、CNV分析及染色体核型分析检测结果

3、讨论

胎儿染色体缺失或重复类型多而复杂，且多为新发突变，检测和分析难度较大，一直是产前

诊断研究的难点和热点。NIPT 技术可通过母血中胎儿游离DNA对胎儿染色体进行检测，常见非整倍体检测已应用于临床，但在胎儿其他罕见染色体非整倍体和微缺失/重复的检测方面尚处于研究阶段。近年来有研究者通过改善测序方法或加深测序深度来提高NIPT染色体缺失或重复的灵敏度，而且发现应用NIPS-Plus技术对性染色体非整倍体和22q11.2微缺失的检测有较高的检测效能[8]。

9号染色体包含约1.41亿个DNA碱基对，约占细胞DNA总数的4.5%。9号染色体包含2 466个基因，包括605个OMIM基因，其中有160余个已被证明与疾病有关[9]。其中9号染色体三体综合征及其片段微缺失/重复，因其具有低患病率和高早期致死率的特点，在临床上产前筛查和产后诊断均相对困难。许多患儿在妊娠早期超声筛查结果正常，或仅发现NT增厚等软指标异常，或母体血清筛查存在风险，而在妊娠中、晚期或出生后才会被发现严重的胎儿/新生儿畸形。随着NIPT技术在检测其他罕见染色体非整倍体和微缺失/重复中的研究进展，近年来也有对9号染色体三体综合征及其片段微缺失/重复的产前筛查病例报道[9-10]。目前NIPT的适宜孕周为12+0～22+6周，检测结果提示为9号染色体异常时，较早提供遗传咨询并及时进行介入性产前诊断，对后续的遗传咨询和临床诊断尤其重要。

9-三体综合征是继21、18、13-三体综合征之后发生在新生儿中的第4种常染色体异常，新生儿病死率较高。完全型9-三体综合征患者多数在孕早期胚胎停育或流产，约占自然流产的2.4%,而文献[10-11]报道的病例多为嵌合型9-三体综合征。嵌合型9-三体综合征临床表型与完全型9-三体综合征相似，而临床症状比完全型9-三体综合征更轻，表现为多发畸形，包括生长发育迟缓，球鼻、小眼球等特殊面容，关节畸形，以及关节位置异常和(或)功能异常及其他骨骼发育不良，先天性心脏缺陷，肾脏系统异常，还伴有严重的精神发育障碍[12-14]。而且嵌合体患者生存期比非嵌合体患者长，低比例嵌合型9-三体综合征的个体可存活到青少年期[13]。嵌合型9-三体综合征患者临床表现随着异常细胞所占比例不同而有所变化，嵌合比例越高，异常表现越明显。当怀疑嵌合型9-三体综合征时，需要使用未培养细胞进行基因检测，以便更准确地反映嵌合型9-三体综合征比例。本研究中8例孕妇经NIPT提示为9号染色体数目增多，经介入性产前诊断，结果未发现完全型9-三体综合征，病例2、6和7经产前诊断均为嵌合型9-三体综合征，其嵌合比例为9%～60%,孕妇B超检查均出现不同程度异常，均选择终止妊娠；1例孕妇产前诊断结果为其他染色体平衡易位，结果不相符；其余4例孕妇产前诊断均为未见异常，结果不相符。NIPT 9-三体综合征的阳性预测值为37.50%(3/8),与文献[9,15]报道结果一致。但本研究中NIPT对于9-三体综合征的检测仍存在较高比例的假阳性，分析其原因为NIPT技术通过检测母血中胎儿游离DNA,其结果的灵敏度受限制性胎盘嵌合、母血中胎儿游离DNA水平、胎儿游离DNA片段的大小及测序深度等因素影响。而常规染色体核型分析技术可以检测染色体数目和结构异常，但不能检测小于10 Mb的染色体异常，也不能检测单亲二倍体。CNV分析可以检测出微缺失/重复和低水平嵌合，但不能有效检测出基因组平衡的染色体易位及倒位等异常，目前尚不能完全代替染色体核型分析。因此，对于NIPT提示9号染色体数目增多的病例，仍需要考虑同时进行染色体核型分析及CNV分析检测以明确临床诊断。

9p三体综合征是新生儿中异常最多的染色体病之一，全球目前已有约200例9p三体或9p部分三体综合征的病例被报道[16],其临床表现多为生长发育迟缓、不同程度的智力障碍及头面部异常等[17-19]。而且，其临床症状的严重程度与异常染色体片段中的重要功能基因有关。有研究表明，9p22-9p24区域是9p三体综合征的最小关键区域[19-20]。本研究中病例11经NIPT提示为9号染色体p21.3-p24.3区域重复22.7 Mb, 经CNV分析诊断为9号染色体p21.3-p24.3区域重复23.22 Mb, 14号染色体q11.2区域重复4.56 Mb。其中9p21.3-p24.3重复区域包含66个编码蛋白，临床表型为产后生长迟缓，智力障碍，发育迟缓，身材矮小，特殊面容和骨骼系统异常等[21];14号染色体q11.2处重复区域，包含57个蛋白编码基因，临床表型为重度黄疸、呕吐、脑室内出血、精细动作发育迟缓、认知功能损害、语言发育迟缓、注意缺陷多动障碍、特殊面容及内分泌异常等[22],同时该病例羊水细胞染色体核型诊断为47,XN,+der(14)t(9;14)(p22;q11.2)。9p三体综合征中少数病例是由早期胚胎发育过程中出现新发的基因改变引起，多数病例是由于父母之一携带9号染色体和其他常染色体相互易位的遗传造成的[16,23],因此其表型异质性由9号染色体短臂重复片段和其他常染色体的片段造成。故对本病例父母双方均进行外周血染色体核型分析，结果为一方正常，一方染色体9p22和14q11.2的平衡易位，分析原因为亲代生殖细胞在分裂过程中染色体的异常分离导致胎儿9号染色体p22和14号染色体q11.2的重复。因以上片段重复均为致病性变异，故本病例经充分遗传咨询后自愿选择终止妊娠。

病例10经NIPT提示为9号染色体q12-q21.13重复9.82 Mb, 经介入性产前诊断羊水细胞染色体核型为正常，CNV分析结果为9号染色体q21.11-q21.13重复3.82 Mb, 此区域包含FXN基因，该基因的突变与遗传性小脑性共济失调(FRDA)相关[24],但未发现FXN基因重复导致FRDA的病例报道，此片段重复判断为临床意义未明CNV,故建议孕妇随诊，最终此病例足月分娩，新生儿生长发育未见异常。

9p缺失综合征的临床表现为头及面部畸形，中至重度智力障碍，房间隔缺损，孤独症谱系障碍等，多数病例断裂点位于9p22,关键区域在9p22.2p24.1[25];另一类表现为染色体核型为46,XY的个体外生殖器发育异常，关键区域在短臂最远端9p24.3[26-27]。本研究中病例16经NIPT提示为9号染色体p22.3-p24.2区域缺失11.64 Mb和9号染色体p11.2-p22.3区域重复31.39 Mb, 同时NIPT结果提示胎儿性别为男性。经充分遗传咨询后，孕妇拒绝介入性产前诊断，后经随诊观察发现，其孕30周的B超检查结果提示胎儿外生殖器形态异常，胎儿尿道下裂等，于孕39周足月分娩，新生儿表现为多发畸形，包括腭裂、尿道下裂及双侧隐睾，该孕妇拒绝后续基因诊断和随访。病例16临床表现与文献[26-27]9p24.3缺失导致男性性反转的临床表现相似，但由于此病例拒绝介入性产前诊断和后续随访，无法诊断其是否为9p缺失综合征。

本研究对9号染色体三体综合征及其片段微缺失/重复结果进行分析，其总体阳性预测值为35.71%。对于NIPT假阳性的病例，应常规对胎盘进行检测，以明确NIPT假阳性是否由于限制性胎盘嵌合所致。但在本研究中，所有NIPT假阳性病例都未对胎盘进行检测，从而无法对NIPT结果与产前诊断结果不一致的发生机制进行解释，这是本研究的不足之处。NIPT的孕妇外周血胎儿游离DNA来源于胎盘滋养细胞，染色体核型分析和CNV分析均检测的是羊水细胞，是胎儿脱落细胞。传统细胞遗传学技术选择性刺激中期细胞，而CNV分析使用从未培养的细胞(羊水或脐带血)中提取的基因组DNA,避免了培养引起的不同细胞优先生长造成的假阳性，并且能更准确地识别嵌合的真实水平。同时CNV分析具有检测微缺失/重复和低水平嵌合的优势，是传统细胞遗传学技术的有力补充[3]。因此，在产前诊断中，使用不同诊断方法的组合来提高检测的准确性是十分必要的。

目前NIPT技术主要用于分析21、18、13号染色体非整倍体异常，对于其他染色体检测尚无统一指导意见，仅用于临床研究，其临床应用价值尚需进一步数据积累。美国妇产科医师学会关于NIPT的临床指南指出，不推荐将NIPT作为其他染色体微缺失的筛查方法。2023年ACMG明确推荐应用NIPT筛查性染色体非整倍体异常，但对于RAT则不建议采用NIPT[28]。2016年全国产前诊断专家组编写并发布的《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》[6]明确提出，对于NIPT所检出的常见染色体非整倍体之外的其他染色体异常，应告知孕妇并给予进一步咨询和诊断。

综上所述，NIPT有助于识别孕期其他罕见RAT和微缺失/重复的高风险，但仍然存在一定的局限性。NIPT高风险孕妇必须进行充分的遗传咨询并考虑介入性产前诊断[29]。但本研究入组病例有限，其检测的阳性预测值可能存在一定偏差，同时，限制性胎盘嵌合、母血中胎儿游离DNA的复杂性及测序覆盖深度等因素也可造成较高的假阳性，所以仍需进行大量的研究和数据积累以进一步确认NIPT其他罕见染色体异常的效能，并且需要联合不同的基因诊断方法对其检测结果进行验证，提高对罕见染色体异常的检测效能，以满足临床诊断的需求。

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基金资助:国家重点研发计划(2023YFC2705605);首都临床特色诊疗技术研究及转化应用项目(Z221100007422012);

文章来源:李珊珊,张萌,吕巍,等.无创产前检测9号染色体异常病例的产前诊断和遗传学分析[J].检验医学与临床,2024,21(22):3380-3387.