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微阵列芯片技术在NT增厚胎儿诊断中的价值

2021-01-25 569 上传者：管理员

摘要：目的：探讨微阵列芯片技术在产前颈项透明层（NT）增厚胎儿中的应用价值。方法：收集220例产前NT增厚（NT≥2.5mm）的胎儿，应用单核苷酸多态性微阵列芯片（SNParray）技术检测胎儿染色体拷贝数变异（CNVs），同时进行染色体核型分析。结果：在220例NT增厚胎儿中，染色体核型分析检出32例异常，异常率为14.5%，数目异常占87.5%，结构异常占12.5%，其中21三体最常见（占43.8%），其次是18三体（占21.9%）。SNParray技术在染色体核型分析正常的胎儿中另检出9例异常CNVs，为5例致病性CNVs和4例疑似致病性CNVs。按NT厚度2.5～2.9mm、3.0～3.4mm及≥3.5mm将病例分3组，核型异常率分别为5.6%、7.9%和23.3%，芯片异常率分别为5.6%、11.1%和30.1%，随NT厚度增加，胎儿染色体异常率显著增加。当NT≥3.5mm时，SNParray技术在NT增厚胎儿中共检出31例异常CNVs，与核型分析检出24例相比，检出率高6.8%，差异有统计学意义(P<0.05)，而NT厚度为3.0～3.4mm时，检出率仅提高3.2%，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：NT增厚与染色体异常相关，随着NT厚度增加，胎儿染色体异常率显著增加。SNParray技术在染色体核型分析正常的NT增厚（NT≥3.5mm）胎儿中可进一步检出染色体微缺失和（或）微重复，将遗传学病因的检出率提高6.8%，对临床遗传咨询具有重要价值。

关键词：
NT增厚
单核苷酸微阵列芯片
拷贝数变异
染色体核型
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颈项透明层（nuchaltranslucency,NT）厚度是指胎儿颈椎水平矢状切面皮肤至皮下软组织之间的最大厚度，反映了胎儿颈后皮下淋巴液的积聚程度，是孕早期（11～13+6周）筛查胎儿染色体异常的最佳超声软指标。胎儿头臀长45mm时，95%百分位数NT厚度为2.1mm，胎儿头臀长84mm时，95%百分位数NT厚度为2.7mm,99%百分位数NT厚度不随头臀长增加而改变[1,2]。2016年ACOG指南指出，孕11～14周NT>3.0mm或大于相应胎儿头臀长的99%百分位数视为NT增厚[3]，而国内各医疗机构对NT增厚的截断值尚未统一，其值从2.0～5.0mm不等[4,5]，将NT2.5～3.0mm视为临界增厚，NT>3.0mm判断为增厚最为常见。

1992年，NICOLAIDES等[6]首先发现孕早期胎儿NT的增厚与唐氏综合征密切相关。NT除与染色体数目异常相关外还与致病性染色体拷贝数变异（copynumbervariations,CNVs）存在相关性，检出率为0～15%[7,8,9,10,11]。传统的染色体核型分析技术只能检测片段5～10Mb的染色体畸变，而染色体芯片技术（chromosomalmicroarray,CMA）可将分辨率提高到100kb，能在全基因组范围内检测染色体CNVs[12]。单核苷酸多态性微阵列芯片（singlenucleotidepolymorphismarray,SNParray）技术是一种较新的CMA，可以检出染色体微缺失、微重复和杂合性缺失，近年来已被广泛运用到先天性异常、认知缺陷、发育迟缓或行为问题的诊断中[13]。本研究联合应用染色体核型分析技术与SNParray技术，对220例孕早期超声NT增厚的胎儿进行检测，明确NT增厚胎儿的遗传学病因，分析胎儿NT增厚与染色体异常及CNVs之间的相关性，探讨SNParray在NT增厚胎儿产前诊断中的临床价值。

1、资料和方法

1.1临床资料

选择2013年8月至2019年4月在温州市产前诊断中心进行产前诊断，妊娠11～13+6周超声筛查提示胎儿NT>2.5mm的孕妇220例，孕妇年龄21～44岁，中位年龄31岁，NT厚度2.5～9.0mm，中位厚度3.4mm。所有孕妇均签署知情同意书，并进行临床资料登记，包括年龄、家族史、接触史、产前诊断结果等。

1.2方法

1.2.1标本采集及处理：

无菌条件下穿刺取材。孕11～13周的孕妇选择超声引导下经腹绒毛膜穿刺术，抽取少量绒毛组织；孕16～24周的孕妇选择超声定位下经腹羊膜腔穿刺术，抽取30mL羊水；孕25～38周的孕妇选择超声定位下经腹脐静脉穿刺术，抽取脐静脉血2～3mL。

1.2.2染色体核型分析：

采用常规方法行绒毛、羊水和脐血细胞培养、收获、固定、核型制备和G显带。染色体异常的分析和描述标准依照《人类细胞遗传学国际命名标准2016版》。

1.2.3DNA提取：

采用博尔诚公司的基因组DNA提取试剂盒，提取总DNA，用NanoDrop2000UV-vis测定DNA纯度和OD值（λ260/λ280),OD值1.8～2.0为合格，并在管外壁上做好记录。

1.2.4SNParray技术检测：

采用HumanCytoSNP-12DNAAnalysisBeadchipKits(Illumina,USA）芯片，按照标准的操作手册进行全基因组扩增、DNA片段化、杂交、洗脱、单碱基延伸及染色、洗涤、包被及芯片扫描；或采用AffymetrixCytoScanTM750KArrays(Affymetrix,USA）芯片，按照标准的操作手册进行全基因组DNA酶切、连接、PCR扩增、纯化、片段化、标记、芯片杂交、洗涤及扫描。

1.2.5数据转换及全基因组拷贝数分析：

使用KaryoStudio软件或ChAS2.0软件转换原始数据，并进行全基因组拷贝数CNVs分析。首先将得到结果与已有的正常人群DGV数据库（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）进行比对分析，若发现CNVs在该数据库中有报道，则将其视为多态性的CNVs或正常的CNVs；再与DECIPHER数据库（http://decipher.sanger.ac.uk/）比对分析，是否为已报道明确症状的综合征。对于仍然无法确定致病性的CNVs查询PubMed数据库，是否有相关文献报道。对于缺失或重复区域的基因功能查询OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）及GENE(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）等数据库。

1.3统计学处理方法

应用SPSS18.0进行统计学处理。采用χ2检验进行比对分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1染色体核型分析结果

220例产前标本，包括绒毛16例，羊水189例，脐血15例，染色体核型分析检出32例异常，异常率为14.5%。染色体数目异常占87.5%，结构异常占12.5%。染色体数目异常中21三体综合征最常见（占43.8%），其次是18三体综合征（占21.9%），还包括13三体综合征2例（占6.2%),Turner综合征4例（占12.5%），性别染色体嵌合1例（占3.1%）。同时检出罗伯逊易位1例和染色体多态性8例。结果见表1。4例染色体结构异常的核型图见图1。

表132例NT增厚胎儿异常核型及SNP芯片结果

图14例染色体结构异常的核型图和芯片图

2.2SNParray分析结果

在染色体核型结果正常的NT增厚胎儿中，SNParray额外检出致病性CNVs5例，疑似致病性CNVs4例。除1例大片段嵌合型重复，其余8例均为微缺失或微重复，大小0.54～10.10Mb，包括1例DiGeorge综合征和2例Williams-Beuren综合征，结果见图2。SNParray技术染色体异常检出率为18.6%，与染色体核型分析（为14.5%）相比，提高了4.1%。另外，6.82%(15/220）的标本携带意义未明CNVs。结果见表2。

2.3NT厚度与胎儿染色体异常及CNVs的相关性分析

按NT厚度2.5～2.9mm、3.0～3.4mm及≥3.5mm将病例分3组，当NT≥3.5mm时，SNParray技术在NT增厚胎儿中共检出31例异常CNVs，与单纯核型分析检出24例相比，差异有统计学意义（P<0.05），而NT厚度为3.0～3.4mm时，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

图28例微缺失或微重复SNParray图

3、讨论

NT厚度被公认为产前筛查染色体异常和多种胎儿畸形的有效超声软指标。NT增厚胎儿中，大约20%存在染色体异常[14]。SNIJDERS等[1]调查了96127例NT增厚胎儿，发现染色体异常中约50%为21三体综合征，25%为18三体综合征或13三体综合征，10%为Turner综合征，5%为三倍体，10%为其他染色体异常。本组220例NT增厚胎儿中，染色体核型分析检出32例异常，异常率为14.5%，数目异常占87.5%，结构异常占12.5%，其中21三体综合征14例（占43.8%），其次是18三体综合征7例（占21.9%),13三体综合征2例（占6.2%),Turner综合征4例（占12.5%），性别染色体嵌合1例（占3.1%）和染色体结构异常4例（占12.5%），除未见三倍体外，其余与文献相符。

NT增厚除与染色体数目异常密切相关外，还与致病性染色体CNVs存在相关性，异常率约0～15%[7,8,9,10,11]。PAN等[15]对122例荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）检测结果正常的NT>3.5mm病例行CMA检测，可额外检出致病性CNVs7例（占5.7%），其中3例微缺失/微重复无法被传统的核型分析识别。LEUNG等[16]发现，微缺失/微重复综合征在染色体核型正常的NT增厚胎儿中发生率约10%，若中期合并其他超声结构异常，微缺失/微重复发生率则更高。本研究通过SNParray技术明确了4例染色体核型结构异常的片段性质，同时在染色体正常胎儿中额外检测出9例异常CNVs,5例致病性CNVs和4例疑似致病CNVs。因此，联合应用SNParray检测可提高NT增厚胎儿染色体CNVs的检出率，同时可明确染色体结构异常的片段性质，为临床遗传咨询提供理论依据。

本研究检出的3例致病性CNVs为DiGeorge综合征和Williams-Beuren综合征。DiGeorge综合征（22q11.2微缺失综合征）由22q11.2上约3Mb的片段缺失引起的，是最常见的染色体微缺失综合征之一，新生儿发病率为1/4000，主要临床表型为心脏缺损、免疫缺陷、语言延迟，腭咽闭合不良、行为和精神异常、特殊而容和低钙血症等[17]。约94%DiGeorge综合征病例的缺失是新生的，6%则遗传自父母中的一方[18]。Williams-Beuren综合征是指由7q11.23上约1.5Mb的片段缺失引起的，新生儿发病率为1/25000～1/7500，主要临床表型为心血管系统疾病、特殊面容、智力低下、神经行为异常等[19]。

表29例核型正常的SNParray检测结果

表3不同NT厚度组间异常检出率的比较[例（%）]

近年研究发现，早孕期的NT增厚与染色体异常、主要先天畸形、围产期胎儿损失以及不良结局相关，并随着NT增厚的程度风险逐渐加大。NT厚度2.5～3.5mm时，异常率为3.7%,NT厚度3.5～4.4mm时为21.1%,NT厚度4.5～5.4mm时为33.3%,NT厚度5.5～6.4mm时为50.5%,NT厚度≥6.5mm时为64.5%[20]。本研究按NT厚度2.5～2.9mm、3.0～3.4mm及≥3.5mm将病例分3组，核型异常率分别为5.6%、7.9%和23.3%,SNParray异常率分别为5.6%、11.1%和30.1%，胎儿染色体异常率随NT厚度增加显著增加，与文献相符。MAYA等[21]分析了1588例NT增厚胎儿CMA结果，其中胎儿NT厚度≤2.9mm、3.0～3.4mm和≥3.5mm的致病性CNVs检出率分别为1.7%、6.5%和13.8%，认为NT增厚胎儿行CMA检测的cut-off值可定在3.0～3.4mm。本研究中当NT≥3.5mm时，应用SNParray技术在NT增厚胎儿中共检出31例异常CNVs，与单纯核型分析检出24例相比，可将遗传学病因的检出率提高6.8%，两者差异有统计学意义（P<0.05），而NT厚度为3.0～3.4mm时，检出率仅提高3.2%，差异无统计学意义。因此笔者认为，SNParray技术对于NT≥3.5mm胎儿有更高的检测价值。

综上所述，NT增厚与染色体异常相关，随着NT厚度增加，胎儿染色体异常率显著增加。当NT≥3.5mm时，联合应用核型分析技术和SNParray技术对NT增厚的胎儿进行产前遗传学诊断，可将遗传学病因的检出率提高6.8%。

参考文献：

[10]杨鑫,符芳,李茹,等.染色体微阵列分析在模型正常的颈项透明层增厚胎儿中的应用[J].中华医学遗传学杂志,2015,32(3):370-374.

[11]杜柳,谢红宁,郑菊,等.颈部透明层增厚胎儿中CMA技术检测拷贝数变异的分析[J].中华妇产科杂志,2018,53(10):671-676.

周丽丽,温郑静,徐晨阳,李焕铮,徐雪琴,唐少华.微阵列芯片技术在颈项透明层增厚胎儿诊断中的应用价值[J].温州医科大学学报,2021,51(01):19-24.