复发性外阴阴道假丝酵母菌病（recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC）是由外阴阴道假丝酵母菌病在一年内发病4次或以上发展而来的[1]。RVVC主要由假丝酵母菌感染诱导所致，以反复外阴阴道瘙痒、灼热痛、豆腐渣样白带为主要临床表现。遗传易感性、免疫力改变、糖尿病、性活动以及口服避孕药或抗生素的使用等均是RVVC的诱发因素[2]。西医普遍以广谱抗生素多次用药疗法治疗此病，但是治疗过程漫长，反复使用抗生素也会增加耐药菌株的发展风险，且长期应用此类药物可导致阴道菌群发生紊乱。近几年提出的阴道微生态理论为RVVC诊断和治疗都提出新的方向，阴道菌群的失调可能是RVVC患者低治愈率、高复发率的重要原因[3]。目前关于RVVC阴道菌群的特征一直存在争议性报道，本文采用16S r RNA和内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）高通量测序技术分析RVVC患者的阴道细菌和真菌菌群结构，同时探讨地榆炭对临床分离的白色念珠菌的抑制作用，为防治RVVC的中药研发提供新的思路和理论依据。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1研究对象

选取2022年9-12月在南京鼓楼医院妇科就诊的RVVC患者15例（RVVC组），年龄22～48岁，有外阴瘙痒以及白带增多呈乳酪或豆腐渣样等症状并且1年内实验室镜检念珠菌阳性4次或以上，入选的患者均预先进行高危因素的问卷调查，排除合并人乳头瘤病毒、AIDS、衣原体、支原体、滴虫、细菌性阴道炎等疾病。另外招募10名健康育龄期女性作为对照组。所有研究对象1个月内均未使用抗生素、免疫抑制剂以及阴道用药，3 d内无性生活或阴道灌洗。

1.1.2实验试剂

DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.®Soil DNA Kit,Omega Bio-Tek);Fast Pfu Polymerase(Trans Gen);Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences）；建库试剂盒（NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit,Bioo Scientific）；测序试剂盒（Mi Seq Reagent Kit v3/Nova Seq Reagent Kits）购自Illumina公司；沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基均购自Solarbio公司；科玛嘉念珠菌显色培养基购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；卷曲乳酸杆菌CICC24879购自上海微鲁科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样本采集

样本采集时间为非经期，严格遵守妇科检查的操作规范：碘伏消毒研究对象的外阴，使用一次性窥阴器扩张阴道，将无菌棉拭子经患者阴道置于后穹窿，采集分泌物于3个无菌管内，1管用于实验室镜检，另外2个无菌管中分别加入1 m L灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子，转移液体至离心管中，离心半径10 cm,3 000 r/min离心10 min，弃上清，置于-80℃保存。本实验所用样本来源于南京市多中心生物样本库，南京大学医学院附属鼓楼医院生物样本库，每例样本的使用均获得捐献者的知情同意，并经过规范化伦理审核。

1.2.2基因组DNA提取和PCR扩增

采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit提取白带样本中微生物基因组DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，超微量分光光度计Nano Drop2000检测DNA的纯度和浓度。选择上游引物341F:5'-CCTAYGGG RBGCASCAG-3'和下游引物806R:5'-GGACT ACNNGGGTATCTAAT-3'，扩增16S r RNA V3-V4区基因片段。选择上游引物ITS1F:5'-CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA-3'和下游引物ITS2R:5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'扩增真菌ITS片段。PCR反应体系20μL，包含5×Trans Start®Fast Pfu Buffer 4μL,2.5 mmol/L d NTPs 2μL，上游引物（10μmol/L) 1μL，下游引物（10μmol/L) 1μL,Trans Start®Fast Pfu DNA Polymerase 0.4μL，模板DNA 10 ng，补dd H2O至20μL。PCR扩增程序：95℃预变性3 min,35个循环95℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s，最后1个循环72℃延伸10 min。每个样本3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合，并使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。PCR产物使用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences）进行纯化。

1.2.3 Illumina测序和生物信息学分析

将纯化后的PCR产物进行定量与均一化，使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit进行建库。利用Illumina公司的Nova Seq PE250平台，由武汉百奥维凡生物科技有限公司完成测序。使用fastp软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类。比对Silva 16S r RNA数据库（细菌）和UNITE数据库（真菌），利用RDP classifier进行OTU物种分类注释，设置比对阈值为70%。利用QIIME2软件进行α多样性和β多样性分析，LEf Se方法进行物种差异分析，FUNGuild平台进行真菌群落功能预测。

1.2.4地榆炭对临床分离的白色念珠菌的抑制作用

将RVVC患者阴道分泌物接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基进行菌落分离培养，挑取单个酵母样菌落接种于科玛嘉念珠菌显色培养基中培养，根据菌落显色不同，鉴定出白色念珠菌（菌落翠绿色）。采用平板计数法检测不同浓度地榆炭醇提取物对白色念珠菌以及卷曲乳酸杆菌的影响。将地榆炭醇提取物（400μg/m L）经培养基梯度稀释成200、100、50、25、12.50、6.25、3.125、1.562μg/m L的药液，置于96孔板中，每孔100μL，重复做3个复孔。挑取单个白色念珠菌落于沙氏葡萄糖液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养过夜，调制成浓度为1.0×106cfu/m L的菌悬液，按照同样的方法制备卷曲乳酸杆菌菌悬液，分别向每孔加入100μL的菌悬液。同时设置空白对照组（仅加菌液），溶剂对照组（加菌液和二甲基亚砜）以及阳性药克霉唑组（加菌液和10μg/m L克霉唑），置于37℃恒温培养箱中静置培养24 h后，对菌液进行梯度稀释，于固体平板涂布均匀，37℃培养24 h，记录菌落数。

1.3统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组阴道细菌菌群结构分析

RVVC患者阴道细菌菌群在门水平上，丰度水平前3位的依次为厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门；在菌属水平上，RVVC组与对照组阴道细菌菌群均以乳酸杆菌属为主，相对丰度为70.08%，且以惰性乳酸杆菌为优势菌。其他相对丰度>1.00%的菌属有加德纳菌、奇异菌属、普雷沃菌属、脲原体和链球菌，见图1（插页2）。

2.2两组阴道真菌菌群组成分及真菌群落的功能多样性分析

RVVC组阴道真菌菌群的α多样性低于对照组，主要表现为物种丰富度指数、菌种丰富度指数、香农指数、辛普森指数、均匀度指数和分类操作单元数目指数，差异均有统计学意义（P均<0.05），见图2A。

此外，利用NMDS分析进一步评估RVVC组阴道真菌菌群的β多样性，发现RVVC组阴道真菌菌群主要分布于二三象限内，而对照组中阴道真菌菌群主要分布于一四象限内，两组菌群表现出明显分类，见图2B。RVVC患者阴道真菌菌群在门水平上主要为子囊菌门，丰度达到99.35%。在属水平主要为念珠菌属，丰度为96.56%，且以白色念珠菌为优势菌，见图3（插页2）。利用LEf Se分析寻找与对照组有差异的菌属，发现念珠菌属和副球菌属明显增加，见图4。

采用FUNGuild数据库对真菌群落功能进行预测发现，RVVC组中未定义腐生菌是主要的优势功能群，相对丰度高达97.13%，远高于其在对照组中的丰度，其余功能群丰度均低于1%。对照组中未定义腐生菌相对丰度最高（39.92%），其次为植物病原菌（4.67%）、动物病原-内生-地衣寄生-植物病原-土壤腐生-木质腐生菌（3.51%）、植物病原-木质腐生菌（2.99%）、内生-植物病原菌（2.82%）、动物病原-未定义腐生菌（1.94%）、粪腐生-内生-垃圾腐生-未定义腐生菌（1.81%）、动物病原-内生-地衣寄生-植物病原-木质腐生菌（1.59%）、动物病原-内生-真菌寄生-植物病原-木质腐生菌（1.12%），见图5。

2.3地榆炭对临床分离的白色念珠菌的抑制实验结果

与空白对照组相比，随着地榆炭醇提取物浓度的增加（25、50、100、200μg/m L），白色念珠菌菌落数明显减少，差异均有统计学意义（t=8.350、8.722、9.137、9.144,P均<0.05），而卷曲乳酸杆菌菌落数显著增多，差异均有统计学意义（t=9.952、6.288、10.440、8.742,P均<0.05），见表1。

图2 RVVC患者阴道真菌菌群多样性分析

图4 RVVC组与对照组的差异真菌菌属比较

图5 RVVC组与对照组的真菌功能预测分析

表1 不同含药培养液的菌液浓度（±s)

3、讨论

RVVC是一种慢性炎症类妇科疾病，大多数持续时间为1～2年，但是一些女性反复感染4～5年甚至几十年，且随着病程的延长而引发尿频、尿痛等尿路感染症状。同时由于瘙痒症状反复发作，特别在夜间瘙痒症状就会加重，严重影响患者的睡眠质量，对患者心理健康及生活质量均会造成极大威胁。有研究发现患有RVVC的女性压力增加，对社交互动、约会和性活动感到高度焦虑和恐惧，更有可能患上临床抑郁症[4]。RVVC不仅影响身体和心理，也给妇女和医疗保健系统带来巨大的经济负担。据统计，全球RVVC的年患病率为1.38亿女性，25～34岁年龄组患病率最高。DENNING等[5]预测到2030年，每年患有RVVC的女性人口估计将增加到近1.58亿。另外，在高收入国家，因为RVVC而造成的经济负担每年可达143.9亿美元。近年来，RVVC发病率呈逐年上升趋势，多项研究表明阴道微生物菌群生态平衡的破坏与RVVC的发生密切相关，阴道内微生态环境的平衡打破，将会导致白色念珠菌的大量繁殖[6-8]。

本研究采用高通量测序的方法评价RVVC患者阴道微生物的细菌和真菌组成谱。16S r RNA测序结果显示RVVC患者阴道中细菌菌群以惰性乳酸杆菌为优势菌，与唐莉等[9]和欧阳才颜等[10]研究一致。而惰性乳杆菌的产H2O2能力下降，阴道内p H值升高，有助于白色念珠菌定植，可能影响RVVC的治愈[11]。ITS测序结果显示RVVC患者阴道以白色念珠菌为优势菌，菌群结构相对较单一，真菌菌群多样性降低，可能与VVC再次发作有关，这与郭海珊[12]研究结果相似。而郑能能等[13]通过对31例RVVC患者与39名健康志愿者女性的阴道菌群进行18S r DNA克隆文库法分析发现，与对照组相比，RVVC组阴道菌群、阴道真菌菌群多样性增加。但本研究α多样性低于对照组，这可能与样本量、采样时间以及检验方法等因素有关。通过FUNGuild数据库从生态学角度预测真菌功能，发现真菌群落的功能在两组之间存在显著差异，对照组阴道中存在共生生态关系，而RVVC组真菌功能单一，微生态失调，这些功能预测有助于找到更适宜RVVC患者阴道修复的优势菌群，为RVVC患者阴道功能菌群发掘提供数据参考。

近年来，中药以其疗效好、安全性高等优点，被普遍作用于临床疾病的辅助治疗。中医将RVVC归属于顽固性“带下病”范畴，多由脾虚引起，脾运失和，湿热蕴于下焦，虫邪滋生所致，故当以清热去湿、杀虫止痒为治疗原则[14]。中药地榆，苦燥湿，寒清热，酸涩收敛，主入血分，为凉涩之专剂。《神农本草经》和《本草正义》等古籍中多次记载地榆可用于治疗带下病[15]。有研究表明经炒炭后地榆的抑菌功效显著增强，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、红色毛癣菌等[16]。目前临床上常用西药抗生素作为首选治疗药物，但是极易发生耐药性，无法彻底根治，病程反复，严重影响患者的日常生活和心理状态。本研究表明临床常用药克霉唑虽然能有效清除白色念珠菌，但该药物长时间服用会出现耐药性，增加了治疗难度。而地榆炭醇提取物对临床分离的白色念珠菌具有抑制作用且促进卷曲乳酸杆菌生长，卷曲乳酸杆菌产H2O2能力最强，是阴道主要的保护性菌属，能够增强阴道上皮细胞的免疫功能以及减弱白色念珠菌的毒力[17]，这些研究结果可为防治RVVC的中药研发提供新的思路和理论依据。但是本研究不足之处在于样本数量较少，FUNGuild数据库预测真菌群落功能研究不够充分，今后仍然需要采用宏基因组测序，研究更多的样本，全面了解RVVC患者的阴道微生态环境，为临床治疗RVVC提供理论依据。

图1 RVVC患者阴道细菌菌群结构分析

图3 RVVC患者阴道真菌菌群结构分析

参考文献:

[6]马啸.复发性外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道微生物的物种组成及其动态变化研究[D].广州:南方医科大学,2017.

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[8]韩月,夏云,谈勇,等.基于夏桂成改邪养正观探讨重建RVVC患者阴道微生态的辨治思路与方法[J].南京中医药大学学报,2020,36(6):799-800,803.

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[10]欧阳才颜,刘木彪,黄宜娥,等.外阴阴道假丝酵母菌病的阴道菌群结构分析[J].热带医学杂志,2014,14(11):1434-1437.

[11]肖卓然,白会会,刘朝晖.惰性乳杆菌对女性生殖道健康影响的研究进展[J].中国微生态学杂志,2022,34(11):1348-1351,1355.

[12]郭海珊.高通量测序分析妊娠期VVC患者治疗前后阴道真菌菌群的变化[D].广州:广东医科大学,2020.

[13]郑能能,刘玮,漆丽娅,等.复发性念珠菌性阴道炎患者阴道真菌菌群多样性研究[J].浙江预防医学,2012,24(2):13-16.

[14]孙婕,陈迎春,杨娜,等.加减参苓白术散联合盐酸特比萘芬对脾虚型复发性外阴阴道假丝酵母菌病临床疗效的影响[J].河北中医药学报,2023,38(1):31-35.

[15]曹爱民,张东方,沙明,等.地榆中皂苷类化合物分离､鉴定及其含量测定[J].中草药,2003,34(5):397-399.

[16]顾薇,姚俊宏,陆梦梦,等.基于“炒炭存性”理论研究炮制工艺对地榆抑菌功效的影响[J].中草药,2022,53(4):1042-1050.

基金资助:江苏省重大疾病生物资源样本库妇产疾病子库(BM2015004);江苏省重大疾病生物资源样本库妇产疾病子库(南京鼓楼医院生物样本库)开放课题(TC2021B021); 南京大学中国医院改革发展研究院课题项目(南京鼓楼医院医学发展医疗救助基金会资助项目)(NDYG2022001);

文章来源:葛美玲,宋金云,程旭希,等.RVVC患者阴道菌群结构及地榆炭醇提取物抑菌效果研究[J].热带医学杂志,2024,24(08):1084-1088+1149+1216.