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榆栀止血颗粒对功能失调性子宫出血大鼠凝血功能影响

2024-08-15 11 上传者：管理员

摘要：目的：观察榆栀止血颗粒对功能失调性子宫出血(dysfunctional uterine bleeding, DUB)模型大鼠凝血功能的影响，探讨榆栀止血颗粒抑制子宫出血的机制。方法：采用给予妊娠大鼠米非司酮(12.4μg/g)和米索前列醇(130 ng/g)灌胃的方法制作DUB模型。除空白组外，模型组和榆栀止血颗粒低(1.5 g/kg)、中(3.0 g/kg)、高剂量(4.5 g/kg)组妊娠大鼠进行造模。榆栀止血颗粒低、中、高剂量组以榆栀止血颗粒灌胃，空白组和模型组以130μL/g生理盐水灌胃，2次/d,连续给药7 d。比较各组子宫出血量，凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin, APTT)、凝血酶时间(thrombin time, TT)、纤维蛋白原(fibrinogen, FIB)凝血功能指标，血清组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-prostanin F1α,6-keto-PGF1α)水平。结果：榆栀止血颗粒中、高剂量组出血量均低于模型组和榆栀止血颗粒低剂量组(P<0.01);榆栀止血颗粒高剂量组出血量低于中剂量组(P<0.01)。榆栀止血颗粒低、中、高剂量组TT、PT、APTT较模型组缩短(P<0.01或P<0.05),FIB水平较模型组升高(P<0.01)。榆栀止血颗粒低、中、高剂量组PAI-1、TXB2水平较模型组升高(P<0.01),t-PA、6-keto-PGF1α水平较模型组降低(P<0.01);榆栀止血颗粒中、高剂量组PAI-1水平较低剂量组升高(P<0.01),榆栀止血颗粒高剂量组TXB2水平较低剂量组升高(P<0.01),榆栀止血颗粒中、高剂量组t-PA、6-keto-PGF1α水平较低剂量组降低(P<0.01);榆栀止血颗粒高剂量组PAI-1水平较中剂量组升高(P<0.01),t-PA、6-keto-PGF1α水平较中剂量组降低(P<0.01或P<0.05)。结论：一定量的榆栀止血颗粒能够减轻DUB模型大鼠子宫出血等症状，这可能与其能够改善凝血功能有关。

关键词：
凝血功能
功能失调性子宫出血
动物模型
大鼠
榆栀止血颗粒
止血
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功能失调性子宫出血(dysfunctional uterine bleeding, DUB)是临床常见的妇科疾病，临床表现为经期出血量多或持续时间长、间隔时间短等，可引起贫血、继发感染等，从临床趋势看该病发病率呈逐年上升的趋势，且该病复发率较高，严重影响了女性的生殖健康[1-2]。目前，该病的治疗主要有药物治疗和非药物手术治疗等。常用药物包括孕激素、雌激素、非甾体抗炎药和抗纤溶药等，其中激素类药物因阴道不规则出血、乳房发生胀痛等不良反应的高发生率、疗效不能令人十分满意和复发率致使临床应用受限[3-4]。中药治疗DUB相较于西药有作用途径丰富、不良反应轻的优势。榆栀止血颗粒由地榆炭、墨旱莲、炒栀子等17味中药配伍而成，具有消炎、止血、修复血管等作用[5-6]。临床上，榆栀止血颗粒多用于排卵型DUB所致的月经量多、中医辨证为热血证者，临床疗效确切，但具体作用机制不清。本研究采用米非司酮、米索前列醇建立早孕大鼠DUB模型，探讨榆栀止血颗粒对DUB的改善作用及对凝血功能的影响，为榆栀止血颗粒临床应用提供实验依据。

1、材料与方法

1.1动物

7周龄无特定病原体级Wistar雌性大鼠30只，体质量180～200 g; 10周龄无特定病原体级Wistar雄性大鼠15只，体质量300～320 g;均购自北京维通利华公司，动物合格证号SCXK(京)2016-0006。本研究遵循郑州大学第一附属医院实验动物相关管理和使用的规定，动物实验伦理批准号为K2020-003。

1.2药品、试剂与仪器

榆栀止血颗粒，规格10 g/包，鲁南制药集团股份有限公司产品，批号1471908001。大鼠组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t-PA)检测试剂盒(批号CSB-E07917r)、大鼠纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)检测试剂盒(批号CSB-E07948r)、大鼠血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)检测试剂盒(批号CSB-E08047r)、大鼠6-酮-前列腺素F1α(6-keto-prostanin F1α,6-keto-PGF1α)检测试剂盒(批号CSB-E14411r),均购自武汉华美生物科技有限公司。UV 2300紫外分光光度计，上海天美科技有限公司产品；MR-96A酶标仪，深圳迈瑞医疗器械有限公司产品；Sysmex-CA7000全自动血凝分析仪、Western电泳仪，上海天能生命科学有限公司产品；Bio-rad ChemiDoc XRS+成像系统，美国Bio-Rad公司产品。

1.3分组、造模与给药

雌性与雄性大鼠在同一条件下分别适应性饲养5～7 d,自由进食饮水，保持室温(25±1)℃、空气湿度55%～65%、12 h光暗循环；然后按照雌∶雄2∶1比例混合饲养，次日清晨检查雌性大鼠阴栓，有阴栓即为大鼠妊娠第1天。将30只妊娠成功雌性大鼠随机均分为空白组，模型组，榆栀止血颗粒低(1.5 g/kg)、中(3.0 g/kg)、高剂量(4.5 g/kg)组5组，每组6只。参照文献[6],采用给予模型组和榆栀止血颗粒3个剂量组大鼠米非司酮(12.4μg/g)与米索前列醇(130 ng/g)灌胃的方法成功建立DUB模型。榆栀止血颗粒低、中、高剂量组以榆栀止血颗粒溶液灌胃，空白组和模型组以130μL/g生理盐水灌胃，2次/d,连续给药7 d。

1.4检测指标

1.4.1子宫出血量

模型组和榆栀止血颗粒低、中、高剂量组大鼠在给药后立即将1个棉球(85～100 mg)放入阴道，并于下次给药时更换，直至给药结束。末次给药后，取大鼠尾部静脉血20μL,溶于4 mL(V1)50 g/L氢氧化钠溶液，制成大鼠静脉血溶解液。同时取适量质量分数50 g/L氢氧化钠溶液浸泡洗涤收集的带血棉球，重复洗涤直至溶液无色，制成棉球血浸提液，过滤并记录氢氧化钠消耗体积(V2)。在546 nm波长处测定浸提液和大鼠静脉血溶解液的吸光度(A)值。子宫出血量(μL)=[静脉血量(μL)×A棉球血浸提液×V2(mL)]/[A静脉血×V1(mL)]

1.4.2凝血功能

末次给药后，腹腔主动脉取血，与质量分数38 g/L枸橼酸钠按9∶1混合，轻轻摇匀，离心，取上清液待测。置于37℃水浴中，温育5 min;采用全自动血凝分析仪测定凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)、凝血酶时间(thrombin time, TT)、纤维蛋白原(fibrinogen, FIB)。

1.4.3血清PAI-1、t-PA、6-keto-PGF1α、TXB2

取大鼠血清，采用酶联免疫吸附试验分别按照试剂盒说明测定血清PAI-1、t-PA、6-keto-PGF1α、TXB2水平。具体方法如下：加入准备好的样品和对照品，样本稀释后，加入检测抗体，37℃孵育60 min;洗板5次，加入底物A和B液，37℃避光孵育15 min;加入终止液；15 min之内读取吸光度并计算其水平。

1.5统计学分析

采用SPSS 25.0软件处理。数据以均值标准差(s)表示，多组间比较用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠子宫出血量的影响

模型组出血量较空白组增加(P<0.01);榆栀止血颗粒中、高剂量组出血量均低于模型组和榆栀止血颗粒低剂量组(P<0.01);榆栀止血颗粒高剂量组出血量低于中剂量组(P<0.01)。见表1。

注：与空白组对比，**P<0.01;与模型组对比，##P<0.01;与低剂量组对比，△△P<0.01;与中剂量组对比，**P<0.01。

表1榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠子宫出血量的影响

2.2榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠凝血功能的影响

模型组大鼠的TT、PT、APTT较空白组延长(P<0.01或P<0.05),FIB水平较空白组缩短(P<0.01);榆栀止血颗粒低、中、高剂量组TT、PT、APTT较模型组缩短(P<0.01或P<0.05),FIB水平较模型组升高(P<0.01)。见表2。

2.3榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠血清PAI-1、t-PA、6-keto-PGF1α、TXB2的影响

模型组大鼠血清PAI-1、TXB2水平较空白组降低(P<0.01),t-PA、6-keto-PGF1α水平较空白组升高(P<0.01)。榆栀止血颗粒低、中、高剂量组PAI-1、TXB2水平较模型组升高(P<0.01),中、高剂量组t-PA、6-keto-PGF1α水平较模型组降低(P<0.01)。榆栀止血颗粒中、高剂量组PAI-1水平较低剂量组升高(P<0.01),榆栀止血颗粒高剂量组TXB2水平较低剂量组升高(P<0.01),榆栀止血颗粒中、高剂量组t-PA、6-keto-PGF1α水平较低剂量组降低(P<0.01)。榆栀止血颗粒高剂量组PAI-1水平较中剂量组升高(P<0.01),t-PA、6-keto-PGF1α水平较中剂量组降低(P<0.01或P<0.05)。见表3。

表2榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠凝血功能的影响

表3榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠血清PAI-1、t-PA、6-keto-PGF1α、TXB2的影响

3、讨论

DUB属于异常子宫出血，大多由非生殖器官及全身器质性病变、生殖内分泌轴功能紊乱导致[7-8]。DUB或出血量多，或持续时间过长，或间隔时间过短，可引起贫血、继发感染、不孕，严重者可导致失血性休克，甚至危及生命。中医学认为DUB的主要病机为冲任损伤、不能固摄[9-10]。导致冲任损伤的原因以血热、气虚较为常见。临床治疗以固冲止血、扶正益气为主[11]。榆栀止血颗粒组方源自安徽名老中医徐志华教授临床实践总结的验方，对DUB所致的月经量过多且辨证为血热证者效果良好。前期的现代药理学实验[12-14]证实，方中大部分药物具有抗炎、抗纤溶、促进凝血、促进子宫内膜修复的作用。

TT、PT、APTT、FIB主要反映机体凝血系统状况[15]。t-PA作为体内纤溶系统的生理性激动剂主要参与人体纤溶和凝血的平衡调节，PAI-1是t-PA的抑制剂，两者结合可使后者失活。两者水平变化与机体纤溶系统状况和凝血功能关系密切[16]。6-keto-PGF1α和TXB2是影响凝血功能的常见因素。6-keto-PGF1α通过抑制血小板聚集而发挥抗凝作用；TXB2由TXA2转化而来，影响血小板聚集和血管收缩[17]。

本研究在前期研究[6]的基础上，通过凝血功能和凝血相关因子PAI-1、t-PA、6-keto-PGF1α、TXB2的水平变化进一步探索榆栀止血颗粒对DUB模型大鼠子宫出血的药理作用及潜在机制。结果发现：造模成功的DUB大鼠凝血功能下降，PAI-1、TXB2水平降低，而t-PA、6-keto-PGF1α水平升高；榆栀止血颗粒一定程度上缩短了大鼠TT、PT、APTT,并升高FIB水平，说明榆栀止血颗粒可通过激活内源性凝血途径、促进FIB转变为纤维蛋白、加速凝血等多条途径发挥促凝血止血作用；一定剂量的榆栀止血颗粒能够升高PAI-1、TXB2水平，降低t-PA、6-keto-PGF1α水平，说明榆栀止血颗粒可能通过调节前列腺素类物质水平，促进子宫内膜血管收缩而发挥减少子宫出血的作用，有利于DUB大鼠子宫出血症状的改善。

综上所述，榆栀止血颗粒能够抑制DUB模型大鼠子宫出血，这可能与其改善大鼠机体凝血功能有关。

参考文献:

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基金资助:河南省中原医学科技创新发展基金会项目(ZYYC202304ZD);

文章来源:娄素卉,张晓川,聂安政,等.榆栀止血颗粒对功能失调性子宫出血大鼠凝血功能的影响[J].中医研究,2024,37(08):75-79.