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雌性大鼠膝关节挛缩模型的制备及其特点研究

2024-08-05 26 上传者：管理员

摘要：目的建立雌性大鼠膝关节挛缩模型，观察雌性大鼠膝关节挛缩模型制备特点。方法雌性SD大鼠18只，随机分为正常组C组（n=6）和手术模型组（n=12）。术后大鼠自然喂养，在手术造模后4周，将12只手术模型大鼠随机分为M组（n=6）和自然恢复组Z组（n=6）。其中M组在造模4周后取出内固定后即刻进行关节活动度测试与取材。Z组大鼠在造模4周后取出内固定后，在自然恢复6周。C组大鼠与Z组大鼠在第10周进行活动度测试与取材。HE观察关节后囊病理变化，免疫组化检测关节囊组织TGF-β1的表达。结果 (1)与同期雄性大鼠手术比较，雌性大鼠麻醉后复苏时间长。(2)雌性大鼠固定4周后，关节活动度下降，关节总受限活动度与关节源性受限活动度均明显增加，出现关节囊纤维化病变，TGF-β1的表达明显增加。(3)取出固定自然恢复6周后，与M组比较，自然恢复大鼠的关节囊纤维化病变进一步加重，关节总受限活动度与关节源性受限活动度未明显改变，TGF-β1表达未见明显变化。结论雌性大鼠固定4周导致大鼠出现关节挛缩病变，关节活动度下降，TGF-β1表达明显增加；取出关节内固定自然恢复6周后，雌性大鼠膝关节挛缩病变未明显改善，提示关节挛缩模型成功。但雌性大鼠在造模时麻醉复苏时间长，存在麻醉意外风险。

关键词：
动物模型
大鼠
挛缩
膝关节
膝骨关节炎
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膝关节挛缩僵硬临床较为常见，是膝关节骨折、膝部软组织损伤、膝骨关节炎或膝关节置换术后的常见并发症[1]，也是人体关节中易发生挛缩僵硬的部位之一。国内外有关膝关节挛缩动物模型的研究对象包括兔、大鼠、猴、犬等，其中，大鼠可操作性强，更经济，术后存活率高，是目前造模最佳选择。研究表明[2]，雌激素可直接作用于软骨细胞实现对关节软骨的调控和保护，此外，雌激素可活化肌成纤维细胞中的雌激素受体、减少胶原的合成，从而抑制纤维化过程，对膝关节退变具有一定保护作用，但目前大鼠膝关节挛缩模型以雄性大鼠为主，尚无雌性大鼠的研究。考虑到性别因素可能会影响造模过程和结果，因此，本研究将以雌性大鼠作为实验对象，并与同期雄性大鼠进行对比。观察常规雄性大鼠膝关节挛缩模型的造模条件是否适用于稳定的雌性大鼠膝关节挛缩模型的制备，并探讨雌性大鼠膝关节挛缩机制。

1、资料与方法

1.1实验动物及分组：

雌性SD大鼠18只，随机分为正常组C组（n=6）和手术模型组（n=12）。术后大鼠自然喂养，在手术造模后4周，将12只手术模型大鼠随机分为M组（n=6）和自然恢复组Z组（n=6）。其中M组在造模4周后取出内固定，测量关节活动范围，HE观察关节后囊病理变化，免疫组化检测关节囊组织TGF-β1的表达。Z组大鼠在造模4周后取出内固定后，自然恢复6周。C组大鼠与Z组大鼠在第10周取材，观察相关指标。

1.2关节挛缩模型制备方法

1.2.1按照雄性大鼠造模方式进行[3]，大鼠按0.5mL/100g腹腔注射1%浓度的戊巴比妥钠溶液麻醉。用动物剃刀剔除右下肢毛发。常规手术消毒、铺巾。

1.2.2将各组大鼠置于左侧卧位，以右侧股骨中段为中心，做纵向切口（切口长1cm），逐层分离肌肉，暴露股骨。大鼠膝关节屈曲145°，用电钻（钻头直径0.8mm）向胫骨结节方向打孔，直至钻头出现落空感贯穿股骨（不损伤术区周围肌肉）。0.6mm克氏针穿出定位。在胫骨内侧胫骨结节处做纵向切口，逐层分离肌肉，暴露胫骨结节。再次利用电钻沿克氏针引导方向打孔，直到贯穿胫骨。打孔结束后，克氏针穿过胫骨，将膝关节屈曲固定在145°后，减去剩余克氏针，弯曲克氏针两端，固定膝关节。

1.2.3用1.2mm电钻在右侧股骨外侧髁非软骨区域钻孔，钻孔深度0.5cm，形成小骨创伤窗，使渗血流入膝关节，制造创伤性骨关节炎。生理盐水仔细冲洗手术区域，逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤，如图1。

1.2.4术后大鼠转入无菌垫料保温箱内复醒，待大鼠能自由梳洗毛发后再转入无菌垫料试验笼内喂养，记录大鼠术后复苏时间，观察复苏时呼吸和体温等生命体征。术后3d内，每天对伤口进行换药，观察伤口愈合情况。

图1造模后X线片

1.3造模术后管理：

术后每天观察大鼠的一般情况，包括实验动物的进食、饮水、排泄情况、精神状态、外观及活动状态等。观察大鼠伤口有无肿胀感染，克氏针是否有松动脱出等。

1.4观察指标

1.4.1一般情况观察：

造模术后记录大鼠麻醉苏醒时间，观察复苏情况。

1.4.2膝关节活动度测定：

去除克氏针后，大鼠左侧卧位，保持脊柱直立，髋关节屈曲90°，在外踝处以0.7N的拉力牵引踝关节，使膝关节伸展。以膝关节中心为顶点，顶点、股骨大转子、外踝三者的连线形成的夹角测量关节活动度（ROM1）。第一次活动度测试结束后，在膝关节上下1cm处环形切断全部肌肉，再次测量关节活动度（ROM2）。总关节挛缩角度（Total joint contracture,TJC)=180°-ROM1，肌肉源性受限角度（Myogenic contracture,MC)=ROM2-ROM1，关节源性受限角度（Arthrogenic contracture,AC)=TJC-MC。

1.4.3取材：

关节活动度测试结束后，取术侧膝关节置于10%中性甲醛固定液中固定48h，再转入脱钙液中脱钙6周，用于后续HE检测和免疫组化检测。

1.4.4病理学分析：

脱钙处理后的膝关节标本经脱水、石蜡包埋、切片（切片厚度5μm）后按标准流程进行HE染色，封片后进行镜检。采用Panthera数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，先在40倍下观察全部组织的大体病变，然后分别采集200倍和400倍图片。

1.4.5免疫组化：

膝关节石蜡切片脱蜡，依次进行抗原修复、阻断内源性过氧化物酶和血清封闭，加入一抗TGF-β1(TGF-β1 1:50；北京博奥森生物技术有限公司，货号Bs-20411r）孵育过夜后，在依次加入二抗、DAB显色、复燃细胞核和脱水封片。细胞核染为蓝色，目标蛋白染为棕黄色为阳性表达。使用Image-Pro Plus 6.0软件分析每张切片上目标蛋白的平均光密度（Mean density MD），每张切片选择3个不同区域进行分析，取平均值代表该切片的平均光密度。

1.5统计学方法：

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1大鼠苏醒情况观察：

手术中观察发现，术后雌性造模大鼠麻醉苏醒时间较长，平均苏醒时间为（95.66±29.72)min，远高于同期进行的雄性造模大鼠苏醒的时间（28.83±6.64)min。同时有2只雌性模型大鼠在复苏时出现呼吸减弱的情况，即刻给予胸外心脏按压，头低脚高体位摆放处理，2只大鼠均成功复苏。

2.2膝关节活动度测量结果：

结果显示，与C组比较，M组和Z组的关节总受限活动度与关节源性受限活动度均明显增加（P<0.05）。与M组比较，自然恢复组关节总受限活动度与关节源性受限活动无明显差异。

表1各组大鼠总伸直受限角度、肌肉源性伸直受限角度和关节源性伸直受限角度比较

2.3关节囊苏木精-伊红染色结果：

图2显示，C组大鼠关节囊的结缔组织致密且排列整齐，滑膜细胞形态规则，排列整齐。少量纤维组织质地均一。M组大鼠关节囊滑膜组织增生明显，见团块状胶原纤维，纤维细胞增生且排列紊乱，小细血管增多。Z组滑膜中细血管增生明显，见大量团块状胶原纤维，成纤维细胞弥散分布，胶原纤维细胞增生且排列紊乱，血管增生明显。

图2各组大鼠膝关节囊组织HE染色结果

2.4各组大鼠膝关节囊TGF-β1表达：

TGF-β1在胞浆表达，棕色为阳性表达。与C组比较，M组和Z组TGF-β1表达明显增加（P<0.05），但两组表达无差异。

图3各组大鼠膝关节囊组织TGF-β1免疫组化结果

表2各组大鼠膝关节囊TGF-β1表达比较

3、讨论

3.1雌性大鼠麻醉后复苏时间特点：

本实验观察发现，术后雌性造模大鼠麻醉苏醒时间较长，平均苏醒时间为（95.66±29.72)min，远高于同期进行的雄性造模大鼠苏醒的时间（28.83±6.64)min。赵厚德等[3]研究发现，性别、年龄、温度、湿度等多种因素均可影响机体对麻醉药物的敏感性，不同性别的动物对同一麻醉药物的敏感性不同，其中雄性动物的基础代谢率较雌性高，雄性动物对体内麻醉药物的代谢较雌性快，与本实验中雌性大鼠复苏时间延长这一结论相符。此外，有2只雌性模型大鼠在复苏时出现呼吸减弱的情况，虽经处理后成功复苏，但整个复苏过程说明雌性大鼠对麻醉药物的耐受较雄性大鼠差，选用雌性大鼠手术麻醉意外风险较雄性大鼠高。

3.2雌性大鼠关节挛缩特点：

由于大鼠的膝关节正常生理结构特点，膝关节无法完全伸直，存在伸直受限情况。在本实验中，手术后固定大鼠的总伸直受限活动明显增加，切除膝关节周围肌肉后，得到肌肉源性伸直受限和关节源性伸直受限。本实验发现，固定4周后，所有手术大鼠总伸直受限角度和关节源性受限角度均明显增加，提示关节出现活动受限，三组肌肉源性伸直受限角度无差异，提示本次模型以关节源性挛缩为主。在自然恢复6周后，Z组与M组之间关节活动受限情况无差异，说明本实验中所采用的造模方法可导致膝关节活动度下降，且关节活动度不能自然恢复。病理学结果也显示固定4周后，大鼠关节囊滑膜组织增生明显，见团块状胶原纤维，纤维细胞增生且排列紊乱，小细血管增多。取出固定自然恢复6周后，大鼠关节囊纤维化病变并未减轻，反而出现进一步加重，提示自然恢复不能减轻关节囊纤维化，进一步说明本实验中大鼠膝关节挛缩主要为关节源性挛缩，表明造模成功，在制动所致关节挛缩情况下，关节囊、韧带纤维化病变是关节挛缩僵硬的主要原因。也有前期研究认为，长期屈曲固定后，关节源性挛缩受限是关节屈曲僵硬的主要成分，而肌肉源性受限占比很小，且肌肉源性挛缩可以恢复到正常水平[4]，这可能与生理状态下大鼠膝关节长期处于屈曲体位，屈肌群对屈曲位固定有更好的适应性有关。

3.3 TGF-β1信号通路在创伤性关节挛缩中的作用：

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β）是一种多功能细胞因子，可调节多种组织的分化、增殖和细胞外基质的生成。哺乳动物的TGF-β有3种亚型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1常通过激活下游的Smad2或Smad3发挥作用，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，引起胶原的沉积，进而引起组织纤维化的产生，被认为是与关节僵硬最相关的因子[5],TGF-β/Smad信号通路可以直接作用引起关节囊纤维化，同时也可以作为其他信号通路导致关节囊纤维化的媒介。Zhang Y等[6]在其研究中通过建立大鼠屈曲型膝关节挛缩模型探讨关节囊的分子学改变，发现模型大鼠关节囊TGF-β1表达水平显著升高，与本文研究结果一致。本文研究结果显示固定4周后，模型组TGF-β1较正常组表达显著增高，取出固定自然恢复6周后，与模型组比较，自然恢复大鼠TGF-β1表达未见明显变化。本结果证实TGF-β1相关信号通路参与了关节囊纤维化进程。

4、结论

雌性大鼠固定4周导致大鼠出现关节挛缩病变，关节活动度下降，TGF-β1表达明显增加；取出关节内固定自然恢复6周后，雌性大鼠膝关节挛缩病变未明显改善，提示关节挛缩模型成功，且膝关节挛缩的机制可能与关节囊中TGF-β1信号通路激活有关。但雌性大鼠在造模时麻醉复苏时间长，存在麻醉意外风险。

参考文献:

[1]王金亮.中药熏洗联合功能锻炼治疗髌骨骨折术后膝关节僵硬的临床疗效[J].中国医药指南,2016,14(4):183-184.

[2]武云云,阿不都许库尔,阿不力米提.大鼠膝关节挛缩模型的建立与技术要点[J].临床和实验医学杂志,2018,17(11):1126-1129.

[3]赵厚德,陶钧,郝智慧.影响实验动物麻醉的因素[J].实验动物科学与管理.2006,23(1):57-58.

基金资助:四川中医药高等专科学校2022年自然科学基金(22ZRYB06);四川中医药高等专科学校科研创新团队(TD-2022-04);绵阳市高等教育“三三工程”(优势特色专业-康复治疗技术专业建设)(202055);

文章来源:税晓平,王晓梅.雌性大鼠膝关节挛缩模型的制备及其特点研究[J].哈尔滨医药,2024,44(04):53-55.