碳青霉烯类抗菌药物具有广谱抗菌、多系统治疗有效等特点，曾被称为治疗耐药阴性杆菌的最后一道防线。随着耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)的检出率不断上升，抗菌药物治疗效果逐渐变差，严重威胁公众健康，故迫切需要在全球范围内建立区域性监测，实施更有效的抗菌药物管理和感染控制措施，以防碳青霉烯类耐药在全球范围内的进一步传播[1],尤其是CRE血流感染(CRE-BSI),它对大多数可用抗菌药物表现出耐药性，且与高病死率有关。本研究回顾性分析了山东省济宁市第一人民医院2021-2022住院患者血液检出CRE的临床分布特征及耐药性特点，以期为临床提供相关数据，为防控管理和治疗CRE-BSI提出依据。现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

回顾性收集2021-2022年山东省济宁市第一人民医院住院的21例CRE-BSI患者(共21株菌株，菌株要求对至少一种碳青霉烯类药物耐药，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等),21株菌株均为在血液标本中检测出的耐药菌株。于-80℃超低温冰箱保存。编号为1～21,检测为肺炎克雷伯菌标示为KP,大肠杆菌为EC,霍氏肠杆菌为EH。质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603,大肠杆菌ATCC25922,霍氏肠杆菌ATCC700323,由国家卫生健康委员会临床检验中心(北京医院)提供。

1.2仪器与试剂

生物安全柜(海尔集团公司，型号：HR40-II A2);二氧化碳培养箱(长沙长锦科技有限公司，型号：CP-QT100A);全自动细菌培养系统(美国碧迪公司，型号：BACTEC FX);全自动微生物质谱检测系统(法国生物梅里埃公司，型号：VITEK MS);全自动微生物鉴定药敏分析仪(美国碧迪公司，型号：PhoenixTM M50)及配套药敏培养液、药敏靶板、细菌浊度仪；-80℃超低温冰箱(海尔集团公司);SPD.RM医用冷藏箱(海尔集团公司，型号：HRC-390R);碳青霉烯酶检测试剂盒[复星诊断科技(长沙)有限公司，商品名称NG-Test CARBA 5]。

1.3方法

1.3.1临床资料收集

通过住院病历系统收集CRE-BSI患者的临床特征及CRE-BSI菌株的科室分布情况。

1.3.2菌株鉴定及药敏试验

检测过程依据《全国临床检验操作规程》第5版相关要求进行细菌培养，使用全自动微生物质谱检测系统鉴定细菌种类。使用全自动微生物鉴定药敏分析仪及配套药敏培养液、药敏靶板等进行药敏试验，并记录检测结果(通常为24 h),按照2022年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M100ED32文件标准分析并收集药敏结果。

1.3.3碳青霉烯酶检测

按照试剂盒说明书制备混合液，加入检测卡盒上标记了S的样本孔，室温放置15 min读取结果。

1.3.4提取菌株DNA

使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取制备好的上清液，作为菌株的DNA模板，放置于-80℃冰箱保存。

1.3.5全基因组测序

将上述DNA模板送至北京百迈客生物科技有限公司，采用Illumina测序。利用超声波将DNA打断成200～500 bp小片段，筛选合适DNA片段加接头后随机附着于flowcell表面，经过桥式聚合酶链反应扩增形成DNA簇，采用边合成边测序的方法，进行全基因组全面、准确的测序。

1.3.6多位点序列分型(MLST)

应用美国国家生物技术信息中心中本地blast板块，进行基因比对并记录结果。

1.3.7耐药基因检测

将上述所得基因组用CARD与Center for Genomic Epidemiology ResFinder-4.1耐药软件分析耐药基因，用VFDB软件分析各菌株毒力因子，参考相关研究统计毒力因子[2-3]。

1.4统计学处理 采

用WHONET5.6软件进行数据处理于分析。计数资料以例数或百分率表示。

2、结 果

2.1 CRE-BSI菌株科室分布情况

重症医学科12株，急诊监护室4株，血液内科2株，呼吸与危重症医学科1株，泌尿外科1株，肝胆外科1株。

2.2 CRE-BSI患者临床资料

年龄0～30岁1例，>30～60岁6例，>60～90岁14例；有基础疾病15例，无基础疾病6例；有侵入性操作17例，无侵入操作4例；使用呼吸机辅助呼吸15例，无呼吸机辅助呼吸6例。

2.3 CRE-BSI菌株的耐药情况

药敏试验结果显示，CRE-BSI菌株对替加环素、多黏菌素/黏菌素、阿米卡星、米诺环素的敏感率分别为85.71%、61.90%、61.90%、57.14%;对青霉素类、培南类、部分喹诺酮类、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦完全耐药。见表1。

2.4 CRE-BSI

菌种分布、产碳青霉烯酶情况及MLST 21株菌株中，10株肺炎克雷伯菌：7株KPC酶、2株NDM酶、1株IMP酶，10株大肠埃希菌和1株霍氏肠杆菌：均为NDM酶，未检测到OXA-48及VIM;10株肺炎克雷伯菌中，6株产blaKPC-2,1株产blaIMP-4,1株产blaNDM-1,1株未检出碳青霉烯酶基因型，其中1株同时产blaNDM-1、blaNDM-5,blaOXA-1;10株大肠埃希菌中，9株产blaNDM-5,1株产blaNDM-6;1株霍氏肠杆菌产blaNDM-1。见表2。MLST结果显示，10株肺炎克雷伯菌根据等位基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、onB进行分析，有5株为ST11,其余5株分别为ST307、ST469、ST1 027、ST1 306、ST1 709;10株大肠埃希菌根据等位基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA进行分析，有3株为ST361,3株为ST410,2株为ST167,1株为ST617,1株为ST345。见表3和表4。霍氏肠杆菌未测。

表1 21株CRE-BSI菌株的耐药情况

2.5 CRE-BSI菌株其他耐药基因表达

2.5.1产ESBLs或ApmC酶情况

3株大肠埃希菌产ApmC酶，18株产blaCTX-M,2株产blaCMY-2,8株产blaTEM-1;5株肺炎克雷伯菌株产blaSHV,1株产blaDHA-1,4株产blaLAP。

2.5.2合并膜孔蛋白缺失情况

OmpF、OmpG、PhoE、LamB、OmpK35、OmpK36基因均缺失，未检测到。OmpA/OmpK37在肺炎克雷伯菌中可见表达，OmpA未在大肠埃希菌及霍氏肠杆菌中检测到。 注：同时产碳青霉烯酶时只计入1个菌株数。

表2 CRE-BSI菌株产碳青霉烯酶情况

表3 10株肺炎克雷伯菌ST位点信息

表4 10株大肠埃希菌ST位点信息

2.5.3外排泵过表达情况

SMR家族：21株菌株中均检测到KpnEF;MFS家族：检测到13株tet(A)和10株emrYK/emrAB,其中10株大肠埃希菌均见表达，仅有1株肺炎克雷伯菌携带，21株菌株均检测到emrR;RND家族：21株菌株均检测到具有MarR突变的AcrAB-ToLC,对四环素、环丙沙星耐药，9株同时对头孢他啶耐药，11株AcrEF,21株均检测到Mar A,11株检测到SoxS,仅有1株肺炎克雷伯菌，11株检测到OqXAB;ABC家族，21株菌株中均检测到MsbA。

2.5.4药物作用位点改变情况

12株菌株中检测到Qnr,β内酰胺酶青霉素结合蛋白PBP3突变在21株菌株中均检测到，18株菌株中检测到fos, 3株菌株检测到linG,10株菌株中检测到Pmr,大肠埃希菌均表达，3株菌株中检测到arr, 8株菌株中检测到Mrx/mphA,2株菌株中检测到catl, 14株菌株中检测到dfrA,18株菌株中检测到sul, 11株菌株中检测到eptA,大肠埃希菌均表达；在10株菌株中检测到ArnT、eptB,肺炎克雷伯菌中表达。在17株菌株中检测到gyr, 8株菌株中检测到rmtB。

2.6 CRE-BSI毒力因子携带情况

10株大肠埃希菌中，7株检测到1型菌毛fimH,F1菌毛中focDE、focG未检测到，4株检测到focC,1株检测到P菌毛papAH,papEF、papG未检测到，10株检测到papC,S菌毛sfa未检测出，2株检测到fyuA,3株检测到iutA,10株中检测到iroN,未检测到hlyA和cnf1,编码K1荚膜(kpsMT K1)和第Ⅱ组多糖合成(kpsMTⅡ)的基因未检测出，2株检测到与表达荚膜和免疫逃避相关的wbaZ、galE;大肠菌素C(cvaC)、脑内皮细胞浸润(ibeA)和血清存活率(traT)未检测出。10株肺炎克雷伯菌中，10株检测到1型菌毛fimH;5株检测出iuc, 10株全部检测出iutA,10株均检测出肠杆菌素(ent、fep、fes)和沙门氏菌(iroE、iroN),6株检测耶尔森杆菌素fyuA、irp1、irp2、ybt; 5株检测出同时携带4种基因；均未检测到荚膜多糖rmpA,10株中均检测出LPS rfb locus;均未检测出毒素基因clb。

2.7 21株菌株基因组进化树及部分基因分布

分析相关遗传元件发现，IncX3有9株，InFll有13株，插入序列ISKpn27有6株，且均与碳青霉烯基因KPC-2相关。见图1。

图1 21株菌株基因组进化树及部分基因分布基因组进化树及部分基因分布

3、讨 论

本研究21株CRE-BSI分离菌株患者的年龄多为60岁及以上，其中重症医学科分离出的菌株最多，结合患者临床资料，可能与患者年龄偏大，合并基础疾病、使用呼吸机或有创操作等相关[4]。本研究CRE-BSI药敏试验结果显示，CRE对临床常用头孢菌素、碳青霉烯类等抗菌药物耐药率达95%以上，较敏感的抗菌药物为替加环素、多黏菌素/黏菌素、阿米卡星、米诺环素，与国内相关报道类似[5]。建议临床医生与检验科积极沟通，根据耐药率低的抗菌药物结合药敏结果选择适用药物，从而提高临床抗感染治疗效果。本研究MLST分析结果显示，山东省济宁市第一人民医院CRE-BSI中大肠埃希菌流行的ST为ST410和ST361,与ZHANG等[6]和WU等[7]研究表明大肠埃希菌菌株中流行ST依次为ST167,ST617和ST410,ST131不同，可能是因为地域差异，克隆菌株不同，也不排除由于本研究样本量少，不具有的代表性。肺炎克雷伯菌中主要流行ST为ST11,与其他国内相关研究相同[8]。表明山东省济宁市第一人民医院流行的CRE-BSI可能存在克隆性传播。

CRE-BSI耐药相关机制主要为：(1)产碳青霉烯酶，常见KPC、NDM、和OXA-48,具有水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类的能力[9],造成抗菌药物耐药，本研究结果发现山东省济宁市第一人民医院肺炎克雷伯菌中blaKPC-2为主要类型，大肠埃希菌中为blaNDM-5,与国内流行趋势相同[10]。有研究发现，大肠埃希菌中blaNDM传播主要机制是IncX3质粒的水平传播，肺炎克雷伯菌携带blaKPC-2的质粒是多样的但二者都拥有高度保守的可移动元件核心结构，这使得两种基因广泛传播[6],同时blaKPC-2借助插入序列ISKpn27,完整的序列构成是基因排列顺序为Tn4401-tnpA,Tn4401-tnpR,ISKpn27,blaKPC-2,ISKpn26[11],借助于转座子传播，依据进化树可见相同细菌菌株基因组相似度大，山东省济宁市第一人民医院大肠埃希菌目细菌耐药性也存在水平传播。本研究碳青霉烯酶检测结果显示，NG-Test CARBA 5检测试剂盒对比基因水平检测准确率高，但也有假阳性结果。(2)产AmpC或ESBLS酶，本次编号为KP3的多重耐药菌株未检测出碳青霉烯酶，但检测到它携带产AmpC和ESBLS酶。有研究发现，华东地区的超广谱β-内酰胺酶流行病学调查中常见blaCTX-M型为：blaCTX-M-14、blaCTX-M-55和blaCTX-M-27[12]。山东省济宁市第一人民医院位于华北地区，收集的病例中多见的耐药基因为blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaCTX-M-15,与上述结果稍有不同。此类菌株除了对超广谱β-内酰胺类抗菌药物耐药，还包括一些β-内酰胺酶的抑制剂复方制剂，代表药物有头孢哌酮舒巴坦钠、哌拉西林钠他唑巴坦钠。(3)膜孔蛋白缺失，渗透性降低。本研究21株菌株均表达了OmpK37,这是一类使β-内酰胺类通透性降低的一般细菌孔蛋白，同时还检测到OmpA,可以导致肽类抗菌药物渗透性降低，如多黏菌素、万古霉素等。本研究检测介导抗菌素进入细菌的相关基因均表现为缺失，但是大部分多黏菌素仍敏感可能与其他膜孔蛋白存在相关，如OmpK36等，通过效率较低，抗菌药物效果差[13]。(4)外排泵过表达，这是细菌的保护机制之一，可以识别并排出抗菌药物，产生耐药。本研究结果发现，大肠埃希菌外排泵表达类型普遍多于肺炎克雷伯菌，最常见的为RND家族的AcrAB-ToLC,它对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性增强，甚至造成多重耐药。其整体调控因子Mar A、Mar R、Sox S在菌株有检测到，Mar R可以抑制Mar A,但Mar A蛋白能够与Mar R基因阻遏位点上游的DNA序列(即marbox)结合发挥正反馈作用，抑制mar R基因并激活mar A基因[14],而且AcrEF在AcrAB缺失时可以替代它并且继续产生细菌的耐药性；本研究在一半的菌株中检测到OqxAB外排泵基因，OqxAB在对喹诺酮类、四环素类和氯霉素的耐药性发展中起着重要作用，与国内其他相关研究结果相同[15];MFS家族中tet(A/D)与四环素耐药相关[16],部分菌株检测到的耐药基因多西环素耐药、替加环素抗菌处于中介与之相关；近年来多有检出的SMR家族KpnEF产生多种抗菌药物耐药，在本研究21株菌株均检测到；ABC家族，MsbA位于革兰阴性菌的内膜，并作为脂多糖(LPS)前体核心-LPS的翻转酶，参与细菌外膜的生物发生[17]。(5)药物作用靶点改变[18]。例如：Qnr与药物靶结合，并引起构象变化，产生耐药，与喹诺酮类抗菌药物耐药相关；典型的β内酰胺酶青霉素结合蛋白PBP3突变，导致与碳青霉烯类药物亲和力下降，与菌株耐药性关系明显。(6)生物膜的形成与外排泵、毒力因子、调节基因相关[19],可以避免机体免疫系统杀死细菌，同时对抗菌药物的耐药性增强，生物膜也可以在自然界存在，定植在导管，医疗器械内部等。耐药的产生不仅是耐药基因一种作用，同时还可能与个体差异、染色体变异、药物本身相关。

本次研究中大部分检测到fimH,iroN,大肠埃希菌中还检测到papC、iuc,肺炎克雷伯菌检测到iutA、ent、fep、fes、fyuA、irp、ybt。在上述毒力因子中，黏附素(菌毛、非菌毛黏附物质)的基因介导与宿主细胞或黏膜的相互作用，促进细菌定居和感染[20],是临床患者感染的第一步，监测的毒力因子与此相关。铁载体基因对于获得细菌生长和复制很重要，一项肺炎克雷伯菌感染相关的研究确定铁载体可以激活一种宿主蛋白缺氧诱导因子(HIF)-1α,进行铁载体依赖性细菌播散进而加重感染，这表明通过扰乱铁载体生成不仅防止细菌生长，还可以控制细菌进一步扩散产生更严重的血流感染，另还有研究表明iroN可能与高水平菌血症相关[21],本研究收集的CRE-BSI患者中大部分检测到iroN基因。而毒素与定植、侵袭相关，也可以直接损伤DNA,本次未检测到毒素。荚膜保护细菌不受外界伤害，同时抑制了炎症反应，减少了机体对细菌的清除，肺炎克雷伯菌中检测到相关荚膜，本院菌株检测出毒力因子基因较多，这可能是耐药原因之一。菌株检测到多种相同质粒，如：IncFⅡ、IncX3等，不排除毒力因子借助质粒水平传播，也可进一步行质粒结合试验，明确情况。

综上所述，本院CRE-BSI患者耐药甚至多重耐药不仅是一种产酶作用，而是多种机制共同作用的结果，存在克隆传播与水平传播；临床应该根据耐药大环境，选择相对敏感抗菌药物；重症医学科较其他科室分离菌株较多，需加强抗菌药物使用管控，同时其他科室送检较少，应鼓励积极送检，早期治疗，防止院内流行。

参考文献:

[4]刘洋,陆燕飞,张晓慧,等.耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌血流感染病原学及预后危险因素[J].中华医院感染学杂志,2022,32(14):2081-2084.

[5]农金轻,张春燕,胡守奎,等.2016-2020年某医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布及耐药性分析[J].标记免疫分析与临床,2022,29(4):584-588.

[8]王佳男,李情操,裘雪丹,等.酶免疫层析技术和酶抑制剂增强试验在碳青霉烯酶型检测方面的应用及研究[J].中国卫生检验杂志,2023,33(3):271-274.

[10]李姝丽,吴秀祯,王志贤,等.碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌基因型检测技术研究进展[J].中华医院感染学杂志,2022,32(17):2711-2715.

基金资助:山东省重点研发计划项目(2018GSF118137);山东省医药卫生科技项目(202319010449);山东省济宁市重点研发计划项目(2023YXNS106);

文章来源:邢康齐,薛庆节,石继魁.耐碳青霉烯类肠杆菌血流感染患者耐药基因分析[J].检验医学与临床,2024,21(16):2400-2405.