骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种常见的全身性骨骼疾病，导致骨脆性和骨折风险增加，其临床表现包括多关节疼痛和骨变形，并在严重情况下可能伴发脊椎和髋部骨折[1-4]。随着人均寿命延长，该病及其并发症的患者数量不断上升[5-7]。目前治疗方法主要分为促骨质合成药物及抗骨质吸收药物，其中成骨细胞功能障碍引起的骨形成减少是该病发生的关键环节之一。成骨细胞主要源自于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的分化，被广泛认为是成人骨重建过程中成骨前体细胞的主要来源，而BMSCs成骨分化能力下降则在OP发展中扮演着重要角色[8-9]。

目前缺乏有效的治疗OP的方法，这使得识别新的药物靶点成为该领域关键性的目标[3,10-11]。已有研究发现其在识别新药靶点方面的有效性，而全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWASs)则为OP的遗传基础提供了深入见解[12-13]。欧洲研究小组首次揭示了E26转化特异性序列1(E26 transformation specific sequence 1, ETS1)中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)易感性之间的正相关关系[14]。Chen等[15]研究发现中国人的ETS1多态性rs73013527与RA易感性和疾病活动性显著相关。ETS1是ETS家族中保守程度最高的蛋白质，在进化过程中表现出显著的稳定性。已知ETS1在正常细胞和肿瘤中调节许多重要生物过程，特别与免疫细胞功能和细胞周期调控密切相关[16]。在人体内，ETS1主要在淋巴组织中呈现高水平的表达，ETS1也在B细胞、T细胞和NK细胞中得到表达，并且在某些刺激条件下能够诱导其他非淋巴细胞类型[17-19]。此外，ETS1还参与骨代谢，在成骨细胞分化和骨发育过程中扮演着重要的角色[20-21]。

前期研究发现，LINC00963对ETS1基因的表达具有正向调节作用，从而促进人骨髓来源间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMSCs)的成骨分化，并减缓OP的进展。这些结果提示靶向LINC00963可能成为治疗OP的潜在策略[22]。本研究旨在验证ETS1在OP患者中的表达水平、分析与SNP之间关系，并探索SNP对ETS1在B淋巴细胞中机制和功能效应方面的影响，为进一步研究OP的发病机制提供一定的理论基础，有可能为OP的防治提供新思路。

1、材料和方法

1.1 临床对象

本研究选取了云南省大理大学第一附属医院脊柱外科在2021年10月至2022年10月期间收治的200例骨质疏松患者作为观察组，同时招募了本院健康体检中心的45名健康人员作为对照组。纳入标准：①符合2017版《原发性骨质疏松症诊疗指南》中关于骨质疏松的标准；②年龄范围为18～70岁，男女均可；③患者必须经过充分知情并同意参与。排除标准：①合并恶性肿瘤、凝血功能障碍或自身免疫性疾病的患者；②有吸毒或滥用抗生素史的患者；③存在急性感染的患者；④合并患有心、肾及肝等重要脏器官严重损害的患者；⑤不配合治疗的患者。本研究经大理大学第一附属医院医学伦理委员会批准，全体受试者均签署了知情同意书，批准文号：DFY20231205001。

1.2 外周血采集及DNA提取

由具备资质的科室护士采集研究对象肘部正中静脉的外周静脉血样2 mL,收集于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝剂采血管。采血后应立即将采血管倒置数次，以确保外周血与抗凝剂充分混合，防止任何可能影响DNA提取效率的凝血反应发生。血液样本短期可存放在冰箱或4 ℃的冷藏室，长期存放则需置于-80 ℃的低温冰箱中，以避免DNA降解。本研究中采用全血基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA。

将红细胞裂解液按照6 mL/2 mL外周静脉血的比例加入，随后立即倒置EP管以确保充分混合。在室温下反应10 min, 并间歇性地倒置EP管。离心并去除上清液后，再次添加红细胞裂解液，并使用低频漩涡均质器将细胞沉淀完全重悬，以实现剩余红细胞的完全裂解。离心沉淀后，向细胞中加入2 mL白细胞裂解液，并倒置EP管以确保充分接触。随后添加1 mL蛋白沉淀液并进行高频振荡快速混合。离心收集上清液，并转移到新的EP管中。加入2 mL异丙醇沉淀DNA,然后用2 mL70 %乙醇处理得到的DNA。最后，在室温下开盖使70 %乙醇完全蒸发。完全蒸发后，加入1 mL DNA溶液。使用Nanodrop超微分光光度计评估DNA的浓度和纯度，并随后在4 ℃下保存以备将来使用。

1.3 ETS1的mRNA表达检测

取EDTA抗凝的OP患者和健康人员的新鲜外周血，并使用LymphoprepTM(alere technologies, AS)梯度离心法获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)[23]。随后，通过免疫磁珠分选技术将CD4+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞进行有效分离。利用TRIzol一步法提取总RNA,并按照TaKaRa反转录试剂盒说明书的指导将mRNA反转录成cDNA[24-25]。最后，以5 μL的cDNA为模板进行反转录PCR实验。ETS1和内参的上游和下游引物序列如表1所示，按照以下公式计算ETS1的相对表达率 =2-Δ(ΔCt)。

表1内参序列和ETS1引物序列

1.4 SnaPshot技术检测

根据NCBI数据库中OPN的DNA序列，筛选含有rs4937333位点的序列，并利用Primer 5.0软件设计特异性扩增该含有rs4937333位点的OPN基因的PCR上游引物、下游引物和延伸引物。采用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶纯化PCR扩增产物，并使用ABI公司的SnaPshot方法进行SNP位点分型。随后，运用SnaPshot Multiplex试剂盒进行延伸实验，将得到的延伸产物经过虾碱性磷酸酶纯化后装入ABI3130XL仪器。最终，借助Gene Mapper 4.0(Applied Biosystems)软件对SNP分型结果进行分析[26]。

1.5 ETS1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体构建

从基因库中提取ETS1基因的3′UTR序列，构建野生型和突变型片段。其中，野生型片段为rs4937333结合位点，而突变型片段则是将ETS1的3′UTR野生型序列在与rs4937333结合位点处进行了突变。这两个片段分别被命名为ETS1-3′UTR WT和ETS1-3′UTR MT。随后，通过酶切、连接和转化步骤将纯化的PCR产物克隆到psiCHECK-2载体上，并分别命名为psiCHECK-2-ETS1-3′UTR WT和psiCHECK-2-ETS1-3′UTR MT。

1.6 质粒转染及双荧光素酶活性测定

将293T细胞复苏后接种于24孔板，在37 ℃ CO2培养箱中进行培养。每个孔使用含有双荧光素酶的Lipofectamine 3000试剂进行转染。将双荧光素酶报告质粒(psiCHECK-2-ETS1-3′UTR WT和psiCHECK-2-ETS1-3′UTR MT)和miRNA 质粒(miR-760 nc和miR-760 mimic)两两分组共转染到293T细胞，共分为4个转染组，既：psiCHECK-2-ETS1-3′UTR WT+miR-760 nc组、psiCHECK-2-ETS1-3′UTR WT+miR-760 mimic组、psiCHECK-2-ETS1-3′UTR MT+miR-760 nc组、psiCHECK-2-ETS1-3′UTR MT+miR-760 mimic组。在转染48 h后，将旧培养基去除，并使用PBS溶液洗涤细胞两次。然后，在每个孔中加入250 μL细胞裂解液，在室温下摇动15 min以收集裂解液。随后，将收集到的细胞裂解液转移到含有萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物的发光板上。通过酶联免疫吸附法检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，并重复实验3次以计算平均值。

1.7 ETS1细胞表达水平验证

经过上述实验得到的样本荧光值检测结果后，接下来将采用qPCR和Western blot法分别对ETS1的mRNA和蛋白的表达进行检测，qPCR法检测步骤见方法3。Western blot法中，将细胞在900 μL的裂解缓冲液(含有50 mmol/L Tris pH 7.6,150 mmol/L NaCl和0.1% NP-40)中进行裂解，并添加了蛋白酶抑制剂。样本配制于分离胶及浓缩胶中进行电泳，然后转移至PVDF膜，在室温下对膜进行脱色处理，使用5 %的脱脂牛奶封闭1 h后加入稀释一抗，4 ℃过夜孵育。洗膜后再次加入稀释二抗，在室温下孵育30 min后洗膜。用化学发光剂显影并获取图像，通过凝胶图像处理软件分析各组表达灰度值。为确保结果可靠性，以β-actin作内参对照，重复检测3次。

1.8 统计学处理

利用卡方检验评估SNP对Hardy-Weinberg平衡(HWE)的依从性。通过GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，数据以

表示。根据数据类型，t检验和方差分析(ANOVA)比较不同基因型样本的ETS1表达差异；其中两两比较采用Dunnett’s multiple comparisons test;t检验比较不同临床表现患者的ETS1表达水平；以上均为双侧检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。所有结果均重复3次。

2、结果

2.1 OP患者和健康人ETS1基因表达水平

经过qPCR实验测定显示OP患者PBMC、CD4+T细胞、CD19+B细胞中的ETS1基因表达水平均低于健康人组，且差异具有统计学意义，见图1。

图1OP患者和健康人体内PBMC、CD4+T细胞、CD19+B细胞中的ETS1基因表达水平

2.2 ETS1基因rs4937333位点基因分型结果

利用SnaPshot技术对32例OP患者及30名健康人进行了ETS1基因-3’UTR区域上SNP位点rs4937333的检测。卡方检验分析显示每个SNP的等位基因频率均显著偏离HWE。结果显示，患者C/T基因型占比为0.44,而健康人组的占比为0.37。同时，qPCR结果表明C/T基因型患者的ETS1表达水平显著低于C/C基因型患者，见图2。这说明ETS1基因3’UTR上rs4937333位点能够影响OP中ETS1的表达水平。

图2rs4937333基因型分布及不同等位基因的ETS1表达水平

CD4+T细胞、CD19+B细胞中不同等位基因的ETS1的mRNA表达水平。*P<0.05;**P<0.01。

2.3 重组双荧光素报告基因质粒psiCHECK-2-ETS1-3′UTR转染293T细胞Luciferase结果

利用双荧光素酶报告基因实验检测发现，携带miR-760 mimic和ETS1野生型3′UTR构建体的相对荧光素酶活性显著下降，与对照组相比差异具有统计学意义(**P<0.01)。然而，在ETS1突变型3′UTR构建体中，相对荧光素酶活性与其对照组之间没有观察到统计学意义上的差异(P>0.05),这表明rs4937333位点与miR-760结合后会影响ETS1的表达水平(见图3A)。进一步通过qPCR和Western blot分析，结果显示变异株细胞ETS1基因表达量相较于野生株细胞较低，且差异具有统计学意义(**P<0.01),表明rs4937333能够调控ETS1的表达水平(见图3B、C),ETS1是miR-760的直接靶向基因。

3、讨论

OP是一种常见的骨骼疾病，其特征在于骨量减少和骨质脆性增加[27]。随着人口快速老龄化，骨质疏松症的发病率不断上升[28-29]。作为具备自我更新和分化能力的异质性细胞群体，BMSCs已被揭示出潜在向成骨细胞分化的能力[30]。深入了解BMSCs成骨分化机制将为治疗骨质疏松提供新机遇[31]。

图3rs4937333位点通过影响miR-760结合调控ETS1的表达

ETS1是ETS转录因子家族的一个成员，被认为是癌症进展的关键驱动因素[32]。越来越多的证据表明，ETS1在骨生成过程中发挥重要作用[33-34]。例如，Qi等[35]详细阐述了ETS1在间充质干细胞成骨分化中的重要调控作用；Fan等[36]报道了ETS1介导miR-532-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制作用；Hua等[37]证实了MALAT1/miR-155-5p轴通过靶向ETS1来调控人牙周膜干细胞的成骨分化。作为一种成骨分化特异性的转录因子，ETS1参与调控多个基因的转录，这些基因在成骨细胞形成和分化、软骨细胞成熟、破骨细胞形成和吸收以及骨基质蛋白合成等关键过程中发挥重要作用[38]。Itoh等[39-40]发现miR-208通过部分调节ETS1的表达与前成骨细胞分化密切相关。Liu等[41]推测miR-1202的下调可能通过靶向ETS1,参与组蛋白乙酰转移酶途径和细胞衰老途径来影响骨关节炎的进展。在本研究中，我们发现患有OP的个体中PBMC、CD4+T细胞和CD19+B细胞中ETS1的表达水平明显低于健康人群，并且这种差异具有统计学意义，证明ETS1是OP的风险基因之一。

此外，根据我们之前的研究发现，ETS1基因rs4937333位点的多态性与促进成骨分化和缓解OP进展密切相关[22]。因此，在本研究中，我们选择对ETS1基因的rs4937333位点进行了多态性分析。结果显示，在OP组中C/T基因型的比例高于健康人组，并且qPCR实验结果表明C/T基因型显著低于C/C基因型。SNP在3′UTR区域可能通过与miRNA结合活性发生改变，从而对靶基因的表达产生影响[42]。Wang等[31]发现ETS1可作为miR-152-3p的直接和功能性靶点，通过调控miR-152-3p/ETS1信号通路，促进BMSCs向成骨分化方向发展。Hu等[43]发现黄芪多糖可以促进hBMSCs的成骨分化和增殖，同时通过下调miR-760减轻了OP对其的影响。此外，Tang等[44]提出mir-760/Myo18b可能成为类风湿关节炎患者治疗中具有前景的靶点。在骨关节炎治疗上，miR-760/HBEGF轴在协调骨关节炎发病中扮演着关键角色，从而将其确定为干预骨关节炎具有前景的治疗靶点[45]。鉴于此，我们提出探究rs4937333的突变是否能够影响miR-760与ETS1 3′UTR的结合，从而影响ETS1的表达。利用双荧光素酶报告基因实验发现，过表达miR-760后的相对荧光素酶活性产生明显下降，而荧光素酶活性在突变ETS1 3′UTR后的293 T细胞中相较于对照组并无变化，另外我们通过qPCR和WB实验检测发现，突变型的细胞中ETS1的表达量都显著低于其在野生株细胞中的表达量。因此上述结果表明，miR-760可以直接靶向ETS1的3′UTR序列中rs4937333位点。

综上所述，经过初步实验验证，本研究证明miR-760能够通过靶向调控ETS1基因3′UTR序列上的rs4937333位点来影响ETS1的表达。这为进一步揭示miR-760在骨质疏松症发生发展机制中的作用提供了实验基础，并为骨质疏松症的临床治疗提供了新思路。

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基金资助:大理大学第一附属医院博士科研启动项目(FY202001);大理大学第一附属医院杰出中青年人才项目(DFYJC-202113);大理大学第一附属医院学科建设骨干项目(DFYGG2022-28); 云南省地方本科高校基础研究联合专项面上项目(202101AO070314);云南省教育厅科学研究基金研究生项目(2023Y0981);

文章来源:刘飞飞,寇南楠,阮玉山,等.骨质疏松患者ETS1的SNP检测及其与miR-760的相关性研究[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(09):1268-1274.