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lncRNA LINC00339调控细胞自噬抑制BMSC成骨的机制研究

2024-08-14 27 上传者：管理员

摘要：目的探讨lncRNA LINC00339调控细胞自噬并抑制骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)成骨分化的可能机制。方法以大鼠原代BMSC为研究对象，根据给予的处理因素不同，分为以下4组：敲减LINC00339组、敲减BECN1组、空载对照组、敲减LINC00339+敲减BECN1组。分别应用ELISA检测试剂盒检测细胞上清液中ALP、BGP、PICP;Western blot检测成骨相关指标BMP2、Osterix、Runx2以及自噬相关蛋白BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62的表达；应用茜素红染色技术检测成骨分化；通过免疫荧光检测LC3斑点。结果与对照组相比，ELISA法检测结果显示siLINC00339组ALP、BGP、PICP显著增高；Western blot结果显示成骨相关蛋白BMP2、Osterix、Runx2和自噬相关蛋白BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达上调；茜素红染色后细胞视野可见成骨明显增多；免疫荧光观察LC3蛋白明显增多，以上结果差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组相比，siBECN1组ALP、BGP、PICP显著下降，成骨相关基因BMP2、Osterix、Runx2和自噬相关蛋白BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62表达下调，茜素红染色后细胞视野可见成骨明显减少，免疫荧光观察LC3蛋白明显减少，以上结果差异均有统计学意义(P<0.05);而双基因操作的siLINC00339+siBECN1组以上各检测结果分别与siLINC00339组和siBECN1组相比差异均有统计学意义(P<0.05),但与对照组相比均无统计学意义(P>0.05)。结论 lncRNA LINC00339可抑制BMSC成骨分化，其机制可能与调控了BECN1参与的细胞自噬现象有关。

关键词：
LINC00339
成骨分化
细胞自噬
骨微结构
骨髓间充质干细胞
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骨质疏松症是一种以全身骨量下降、骨微结构破坏、骨强度降低为特征的全身代谢性骨病，绝经后妇女和老年人为本病的高发人群[1]。据统计，目前骨质疏松症患者已超过2亿[2],随着人口老龄化加剧，骨质疏松症患者逐年增多，已对人类生存和健康带来巨大影响[3]。骨质疏松症起病隐匿，目前临床上采用抗骨质疏松症药物进行骨质疏松症治疗。然而，即使经过药物治疗，骨质疏松症及其导致的脆性骨折依然具有较高的致残、致死率[4]。lncRNA是一类长度大于200 bp,不编码蛋白的DNA产物。lncRNA的调控机制包括通过与miRNA形成复合物、调控靶基因mRNA、染色质修饰、蛋白修饰、作为蛋白骨架的方式[5]。近年来，多项研究表明，lncRNAs已成为许多重要的生理现象和病理过程中的关键调节因子[6-9],lncRNAs与骨质疏松症和其他骨骼疾病的发病机制有着密切的关系[10-11]。2018年，Chen等[12]研究发现LINC00339的异常表达，可导致骨质疏松症的发生风险增加，课题组前期应用生物信息学技术分析验证了LINC00339在骨质疏松患者中存在表达增高，通过实验证实LINC00339可以抑制自噬调控蛋白BECN1的表达；而BECN1调控的细胞自噬可促进BMSC成骨分化，参与骨质疏松的进展。本研究基于前期工作基础及国内外研究现状，运用基因编辑技术，调控LINC00339和BECN1的表达，观察成骨和自噬表型变化，验证LINC00339通过调控细胞自噬参与骨质疏松进展的机制，为骨质疏松症的诊治提供新的理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

6月龄雌性SD大鼠(新疆医科大学动物中心)。主要试剂：α-MEM培养基(上海西宝生物科技股份有限公司，中国);GAPDH (CST,美国);酶联免疫吸附试验测定(ELISA)试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司，中国);胎牛血清(Gibco公司，美国);抗体(北京博奥森生物科技有限公司，中国);实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(南京欧凯生物公司，中国);总RNA提取试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，中国);载体质粒(上海斯信生物科技有限公司，中国);携带阴性对照(NC)及siRNA-LINC00339的慢病毒由上海科维创生物科技有限公司包装完成。

1.2实验方法及分组

6月龄SD雌性大鼠安乐死后，分离股骨和胫骨，暴露骨髓腔，用注射器将α-MEM培养基(含20% FBS、2 ML-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和链霉素)反复冲洗骨髓腔直至骨头发白。收集骨髓液，离心后加入培养基接种于培养基中，置于3℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。第3天更换培养液，用PBS清洗非贴壁细胞。贴壁细胞在新鲜培养基中培养6～8 d,每隔2 d更换培养基，直至细胞融合，然后用0.25%胰蛋白酶消化并传代至第1代。准备完善后进行以下基因干预并分组：分别用慢病毒包装试剂盒包装LINC00339-KD和BECN1-KD质粒(含对照)转染细胞悬液，获得rLV-LINC00339-KD、rLV-BECN1-KD慢病毒；同前，同时敲减LINC00339、BECN1的细胞获得rLV-LINC00339-KD-BECN1-KD慢病毒；以上病毒包装成功后以MOI=5或10感染细胞。同时设空载对照组。用流式细胞术检测，荧光值以判断转染效率，转染48 h后采用RT-qPCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)确定敲减的效率。确定转染成功后根据干预因素不同分以下4组：敲减LINC00339组(siLINC00339)、敲减BECN1组(siBECN1)、空载对照组(NC)、同时敲减LINC00339、BECN1组(siLINC00339+siBECN1)。

1.3检测指标

1.3.1检测血清细胞因子指标：

取出上清液，所有操作严格参照ELISA试剂盒说明书进行检测细胞上清液中碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(osteocalcin, BGP)、血清Ⅰ型前胶原羧基端前肽(PICP)的含量。

1.3.2 RT-qPCR检测成骨相关指标BMP2、Osterix、Runx2和自噬相关指标BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62 mRNA的表达：

Trizol法抽提RNA,以反转录试剂盒合成cDNA,使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，按照试剂盒使用说明进行扩增。反应结束后分别获取Ct值，以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法分析相对表达水平。本研究中LINC00339上游引物序列：5’-CCAAGAGCAATGTCGGATGC-3’,下游引物序列：5’-CGCCTACATAGCATTGCCAT-3’;GAPDH上游引物序列：5’-CCACAACCTCATAGTGTACG-3’,下游引物序列：5’-GGATCTAGTTGAGGTCAACGTTA-3’。

1.3.3蛋白质印迹(Western blot)检测BMP2、Osterix、Runx2等成骨相关指标和BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62等自噬相关指标mRNA的表达：

各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。电泳、转膜后用5%脱脂奶粉封闭液封闭，孵育一抗(1∶1 000稀释)和二抗(1∶3 000稀释),显影成像每个蛋白样品3个重复。

1.3.4茜素红染色：

选择转染成功的细胞进行成骨细胞分化诱导，将培养基更换为成骨培养基，含60μg/mL抗坏血酸、2 mmol/Lβ-甘油磷酸酯、10 nmol/L地塞米松。当细胞融合至80%时，将细胞以每孔3×105和1.5×105的密度接种12孔板，细胞培养14 d进行茜素红染色。各组细胞茜素红染色结果采用Image J软件进行定量分析并运用GraphPad Prism 8.4.2软件进行统计分析。

1.3.5免疫荧光检测：

将准备好的细胞以PBS洗涤3次，每次5 min,在室温下用预冷甲醇固定20 min。在室温下用0.2% Triton X-100通透细胞10 min,洗涤3次，每次5 min,以便抗体能够穿透细胞膜，与内部结构发生反应。室温下在细胞上涂覆用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭60 min以减少非特异性抗体结台。4℃下加入特异性的抗LC3抗体，让其与LC3蛋白结合孵育一抗过夜，用PBS洗涤3次，每次5 min。加入荧光标记的二抗，它会与第一抗体结合，并携带荧光标记，室温下孵育1 h,并用PBS洗涤3次，每次5 min。将细胞用DAPI孵育10 min并用PBS洗涤3次，封片。使用荧光显微镜观察LC3信号的图像。

1.4统计学方法

所有数据均应用SPSS 26.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，采用Image J软件并运用GraphPad Prism 8.4.2软件进行统计分析。多组间的比较使用单因素方差分析，组间两两的比较使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 ELISA检测试剂盒检测ALP、BGP、PICP

结果显示，与NC组相比，siLINC00339组ALP、BGP、PICP显著增高(P<0.05),siBECN1组ALP、BGP、PICP显著下降(P<0.05);双基因操作的siLINC00339+siBECN1组分别与siLINC00339组和siBECN1组对比，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1ELISA检测ALP、BGP、PICP

2.2应用RT-qPCR和Western blot检测成骨相关指标BMP2、Osterix、Runx2和自噬相关BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62 mRNA和蛋白的表达情况

结果显示，与NC相比，siLINC00339组成骨相关基因BMP2、Osterix、Runx2 mRNA和蛋白表达上调，siBECN1组表达量被下调(P<0.05),siLINC00339+siBECN1表达量无明显变化(P>0.05);siLINC00339组自噬相关BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62 mRNA和蛋白表达上调，siBECN1组表达量被下调(P<0.05);双基因操作的siLINC00339+siBECN1组分别与siLINC00339组和siBECN1组对比，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、3。

图2RT-qPCR检测成骨相关指标BMP2、Osterix、Runx2和自噬相关指标BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62 mRNA

图3Western blot检测成骨相关指标BMP2、Osterix、Runx2和自噬相关指标BECN1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白

2.3应用茜素红染色(ARS)技术检测成骨分化

各组细胞成骨诱导分化培养14 d后，观察结果显示，NC组和siLINC00339+siBECN1组经茜素红染色仅见少许散在的橘红色钙化结节，siBECN1组经茜素红染色未见形成具有代表性的橘红色的钙化结节；而siLINC00339组经茜素红染色后细胞视野可见大片散在或连成一片分布于细胞表面的橘红色经典钙结节。见图4。

图4茜素红染色技术检测成骨分化(100×)

2.4应用荧光显微镜观察LC3免疫荧光斑点

准备完善的细胞中的LC3被标记后呈绿色荧光，细胞核DAPI染色呈蓝色荧光。结果显示，与NC组相比，siLINC00339组LC3蛋白明显增多(P<0.05),而siBECN1组LC3蛋白明显被减少(P<0.05);双基因操作的siLINC00339+siBECN1组分别与siLINC00339组和siBECN1组对比，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5免疫荧光检测LC3斑点(100×)

3、讨论

近年来，多项研究表明lncRNAs已成为许多重要的生理现象和病理过程中的关键调节因子，lncRNAs与骨质疏松症和其他骨骼疾病的发病机制有着密切的关系。Zhang等[13]发现，在人BMSC成骨分化过程中，多种lncRNA(XR_111050、NR_024031、FR374455、FR401275、FR406817、FR148647)特征性表达。lncRNA LINC00339是新近发现的与骨量表达具有相关性的lncRNA分子之一，上调LINC00339表达，促使骨质疏松症发生风险升高[12]。目前关于LINC00339分子的研究文献多报导与肿瘤相关，与骨质疏松相关的研究报导较少，其具体调控机制也尚未明确。

骨质疏松症临床患者的全基因组学分析显示，LINC00339表达与骨量具有显著相关性[12];但目前尚无基础实验研究证实调控LINC00339能否在细胞水平、动物水平影响骨量表达。近年来有研究发现抑制LINC00339可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，对高糖作用的成骨细胞有保护作用[14],但LINC00339的表达能否调控细胞自噬目前也尚无研究报导。本研究以大鼠原代BMSC为研究对象，应用基因编辑技术，敲减LINC00339、BECN1的表达后，通过ELISA检测成骨相关指标，茜素红染色、Western blot技术检测成骨及细胞自噬的相关指标以及免疫荧光观察LC3斑点等方法，通过组间对比，结果发现敲减LINC00339可以促进细胞自噬现象和BMSC成骨分化。

众多研究证实，细胞自噬具有调控细胞存活、增殖、分化、血管新生、免疫活性等重要作用[15-18],而BECN1是介导细胞自噬的关键分子之一。细胞自噬可以调控成骨分化已被多项研究报道[19-20],Xu等[21]研究发现，细胞自噬可通过清除ROS途径，保护成骨细胞功能，维护成骨细胞的活性和功能，但自噬过度则可能造成细胞损害；赵丽平等[22]研究发现，成骨细胞内自噬体过度聚集，可造成成骨细胞矿化、增殖活性降低，自噬激活过度，会导致成骨细胞功能和活性下降。因此，适当的激活细胞自噬可促进成骨细胞成骨，但自噬过度则可能抑制成骨。细胞自噬可参与调控骨质疏松症发生、发展[23-25],但其上游调控机制仍未明确，本研究通过双基因敲减LINC00339、BECN1的表达，结果发现敲减LINC00339促进BMSC成骨分化表型可以被敲减BECN1抑制的细胞自噬所缓解，验证了LINC00339可能通过调控BECN1介导的细胞自噬抑制BMSC成骨分化。

综上所述，抑制LINC00339可抑制大鼠原代BMSC细胞成骨分化，其机制可能与抑制了BECN1参与调控的细胞自噬有关，为骨质疏松症的预防和治疗提供新策略和新思路，但其具体、深入的机制尚需要大样本、动物实验等进一步证实。

基金资助:新疆维吾尔自治区人民医院院内项目(20220206);

文章来源:李祖涛,蔡昱,徐江波,等.lncRNA LINC00339调控细胞自噬抑制BMSC成骨的机制研究[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(08):1147-1151+1179.