首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 骨科疾病论文 > 骨质疏松症论文 > 鸢尾素抑制炎症因子表达促成骨分化改善糖尿病小鼠骨代谢研究

鸢尾素抑制炎症因子表达促成骨分化改善糖尿病小鼠骨代谢研究

2024-04-10 93 上传者：管理员

摘要：目的探讨鸢尾素在治疗糖尿病性骨质疏松模型小鼠中的疗效以及相关机制。方法基于6周龄C57BL/6小鼠构建糖尿病性骨质疏松模型小鼠，腹腔注射鸢尾素干预模型小鼠，评估其对小鼠体重、空腹血糖、糖耐量试验等指标的影响，收集小鼠血清检测鸢尾素、CTX、P1NP指标，收集骨组织及骨髓间充质干细胞并检测mRNA Runx2、IL-1β、IL-6的表达量，收集股骨远端并HE染色，量化骨微细结构相关参数。结果鸢尾素治疗后，糖尿病性骨质疏松模型小鼠体重显著下降，空腹血糖显著降低；血清中鸢尾素水平显著上升，CTX水平显著降低，P1NP水平显著升高；骨组织Runx2 mRNA表达量显著上升，IL-1β、IL-6 mRNA表达量显著降低；原代骨髓间充质干细胞Runx2 mRNA表达量显著上升，IL-1β、IL-6 mRNA表达量显著降低；小鼠单位长度骨小梁表面成骨细胞数量、骨小梁面积百分数、骨小梁宽度均限制增加。结论鸢尾素能够抑制骨组织及间充质干细胞炎症因子的表达，促进成骨分化，改善糖尿病小鼠骨代谢。

关键词：
DOP
成骨分化
炎症
糖尿病性骨质疏松
鸢尾素
加入收藏

由于饮食习惯的改变和人们社会经济生活水平的提高，2型糖尿病(T2DM)患者数量不断增加。未经治疗的糖尿病患者通常会出现肾脏、神经和心血管并发症[1],以及骨骼疾病[2],包括糖尿病性骨质疏松症(DOP)。DOP是一种受环境和遗传因素影响的全身性代谢性骨病，表现为骨微结构恶化和骨密度降低[3]。DOP主要是由于长期高血糖导致成骨功能障碍，骨细胞增殖和分化受到抑制[4]。研究表明，在T2DM患者中，DOP的发病率高达60 %[5]。因此，迫切需要了解DOP的病理生理现象和治疗方案。

鸢尾素(Irisin)是纤维连接蛋白III型结构域蛋白5 (FNDC5)的裂解形式，是一种新发现的骨骼-骨骼肌因子[6],已有报道证实高强度运动能够持续增加血清中Irisin的水平[7]。鸢尾素已被证明以自分泌方式发挥作用，促进骨骼肌肥大和挽救神经损伤引起的肌肉萎缩[8]。此外，血循环中的Irisin在多个组织和器官中具有广泛的有益作用，通过刺激皮下白色脂肪的褐变，促进能量消耗，改善饮食性肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗，并参与心血管功能和骨骼重塑[9]。临床证据显示，血清Irisin水平的降低与骨质疏松和骨折的风险增加有关，这在绝经后妇女[10]和衰老人群中都能观察到[11,12]。值得注意的是，长期高血糖会激活体内炎症因子的释放，而炎症环境将直接影响成骨细胞的功能[13]。因此，研究Irisin对DOP模型小鼠体重、空腹血糖水平、血清中骨吸收及骨形成生物标志物、炎症因子的表达情况和骨微细结构的影响有现实意义，本研究表明补充循环Irisin可能是对抗糖尿病性骨质疏松的有效治疗策略。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：

选用SPF级雄性6周龄C57BL/6小鼠24只，适应性饲养1周后按计划进行模型构建及药物干预。所有动物维持12 h光照和12 h暗循环。小鼠自由饮水，固体饲料喂养。在实验期间，所有小鼠每周测量体重。伦理编号为XJMUF1-20220422。

1.1.2 试剂：

Elisa检测试剂盒：Irisin(PI470,Beyotime),CTX(MBS9141384,MyBioSource),P1NP(MBS2500076,MyBioSource);快速血糖测试仪(鱼跃580),重组Irisin(SRP8039,Sigma-Aldrich),NAC(A7250,Sigma-Aldrich),STZ(572201, Sigma-Aldrich);Runx2、IL-6、IL-1β引物订购自上海生工生物，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 构建模型：

适应性饲养1周后，造模前夜8时小鼠禁食不禁水，次日晨8时，STZ溶解于1 %柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，按小鼠体重1次性左下腹腔注射STZ 100 mg/kg, 对照组给予等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。2周后测量小鼠空腹血糖。当小鼠出现多饮、多食、多尿、体重下降，空腹血糖≥16.7 mmol /L表现时，判断为糖尿病模型构建成功[14]。随后进行治疗实验。模型构建过程中小鼠死亡率约为25 %,因此需要适当增加小鼠数量以确保后续动物实验分组。

1.2.2 干预方式：

本研究共分为4组，每组6只：对照组(WT)、模型组(DOP)、治疗组(DOP+Irisin)、阳性对照组(DOP+NAC)。所有糖尿病模型鼠给予充足饮水及高脂饲料，治疗组给与Irisin腹腔注射(100 μg/kg)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)具有抗氧化、抗炎的特点，能够下调IL-1β、IL-6抑制骨髓间充质干细胞(BMSC)的炎症反应[15],因此作为阳性对照药物。阳性对照组给予NAC(75 mg/kg)。对照组给予维持饲料及生理盐水腹腔注射[16]。每周3次腹腔注射，持续8周，共24次。每次注射完成后清洁局部，避免感染。

1.2.3 糖耐量试验：

检测前日17时禁食不禁水，次日晨9时开始实验。先测量所有小鼠尾静脉血糖值，获得0 min数据；按照0.01 mL/g体重灌胃20 %葡萄糖溶液，灌胃完毕开始计时，收集15、30、60、120 min数据。

1.2.4 标本收集：

完成试验后，收集小鼠股骨及血清。分离小鼠双下肢后用纱布剥离肌肉，显露完整的股骨，左下肢股骨剪端两端，冲出骨髓培养原代BMSC,余下的股骨干研磨并提取RNA;右下肢甲醛固定24 h, 严格按照说明书脱钙、包埋、冷冻、切片并完成HE染色。使用Image J测量骨小梁周长，并计数表面成骨细胞数量。

1.2.5 qPCR检测：

收集原代BMSC及股骨样品，加入Trizol, 采用TakaRa 试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time),SYBRGreenⅠ法，严格按照说明书完成去DNA反应、反转录、配制反应体系步骤，最后上机，获得数据。

1.3 统计学处理

所有统计分析和图形展示均使用Graph Pad Prism 8.3软件。所有实验数据均以均数±标准差表示。体重、空腹血糖、血清学指标、mRNA表达等指标均采用单因素方差分析。糖耐量试验采用双因素方差分析。P<0.05即差异有统计学意义。*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1。

2 、结果

2.1 Irisin降低糖尿病模型鼠的体重与空腹血糖水平

与对照组相比，模型组体重及空腹血糖显著升高，差异有统计学意义(图1A～B)。葡萄糖耐量试验显示，腹腔注射葡萄糖溶液后血糖水平在15 min时达到峰值，2 h内血糖水平模型组均显著高于对照组，差异有统计学意义(图1C)。与模型组相比，治疗组、阳性对照组体重及空腹血糖显著降低，差异有统计学意义(图1A～B)。葡萄糖耐量试验显示，腹腔注射葡萄糖溶液后2 h内治疗组血糖水平显著低于模型组，差异有统计学意义(图1C)。

图1 Irisin降低糖尿病模型鼠的体重与空腹血糖水平

2.2 Irisin提高血清P1NP水平降低血清CTX水平

与对照组相比，模型组血清Irisin水平显著降低(图2A),血清CTX水平显著升高(图2B),血清P1NP水平显著降低(图2C),差异均有统计学意义。与模型组相比，治疗组血清Irisin水平显著升高(图2A),血清CTX水平显著降低(图2B),血清P1NP水平显著升高(图2C),差异均有统计学意义。同时，治疗组血清Irisin、CTX、P1NP水平高于阳性对照组(图2C),差异有统计学意义。

图2 Irisin提高血清P1NP水平降低血清CTX水平

2.3 Irisin治疗后抑制骨组织及BMSC炎症因子表达

骨组织及BMSC中，与对照组相比，模型组Runx2表达量显著降低，IL-1β、IL-6表达量显著升高(图3),差异有统计学意义；与模型组相比，治疗组、阳性对照组Runx2表达量显著升高，IL-1β、IL-6表达量显著降低(图3),差异有统计学意义。同时，在骨组织中，与阳性对照组相比，治疗组IL-1β表达量更低(图3B),差异有统计学意义。

图3 Irisin治疗后抑制骨组织及BMSC炎症因子表达

2.4 Irisin治疗后改善骨微细结构

与对照组相比，模型组单位长度成骨细胞数量、骨小梁面积百分数、骨小梁宽度显著减少(图4),差异有统计学意义；与模型组相比，治疗组、阳性对照组单位长度成骨细胞数量、骨小梁面积百分数、骨小梁宽度显著增加(图4),差异有统计学意义。同时，与阳性对照组相比，治疗组单位长度成骨细胞数量显著增加(图4),差异有统计学意义。

3、讨论

鸢尾素(Irisin)是骨骼肌分泌的一种肽，在骨代谢中起重要作用。研究报道，有规律的运动会增加循环中的Irisin[17],然而并不是所有人都有能力坚持运动，尤其是糖尿病患者因为长期高血糖引起的多器官并发症，在身体机能较差的情况下开展一定强度的运动是有困难的，因此，我们需要尝试使用外源性Irisin来防治DOP。

临床研究发现，循环Irisin与绝经后妇女骨质疏松性骨折发生率呈负相关[18]。在患有1型糖尿病的儿童中，稳定改善血糖能够正向调节血清Irisin水平，并促进骨骼健康化[19]。一组临床数据显示，7～13岁的健康儿童中Irisin与定量超声(QUS)检测的骨质量呈正相关[20]。在运动员中，Irisin与骨密度和强度呈正相关，进一步分区域评估骨密度，发现血清Irisin水平与长骨、椎体和颅骨的骨密度呈正相关，表明Irisin对全身骨量均有调节作用[21]。最近，对继发性骨质疏松患者的队列研究表明，这些患者的循环Irisin水平较低，这表明这种因子可能是一种监测这种疾病骨质量的新标志物[22]。已有研究报道，长期高脂饮食、高血糖会诱导体内炎症环境的激活及组织的衰老，最终导致继发性骨质疏松[23]。代谢综合征是一种增加心血管疾病、2型糖尿病和骨质疏松症发病风险的疾病，一项围绕代谢综合征患者的临床研究显示，代谢综合征患者的循环Irisin水平低于健康对照人群。在坚持6个月的低血糖指数饮食后，代谢综合征患者的循环Irisin水平稳定提升[24]。在我们的研究中，DOP模型小鼠循环Irisin显著降低，外源性Irisin治疗后可以有效提升循环Irisin。

图4 Irisin治疗后改善骨微细结构

研究显示，骨骼肌干细胞条件性培养基能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化，且上调成骨标志物ALP和Col1aI的表达。同时，Irisin中和抗体能够逆转这种上调作用，所以可以推测是骨骼肌分泌的Irisin在发挥功能[25]。值得注意的是，Kim等[9]发现整合素αV/β5是Irisin在骨细胞上的受体，证实了肌因子对这些细胞的直接作用。大量体外和小鼠模型实验表明，重组Irisin促进成骨，保护骨细胞免受地塞米松诱导的凋亡，防止废用性骨和肌肉质量损失，并加速骨折愈合[26]。此外，鸢尾素通过提高成骨细胞的活力直接影响成骨细胞。另一项研究显示，在模型中，Irisin能够上调废用性骨质疏松模型小鼠骨皮质中Opg的表达，作为一种成骨细胞分泌的因子，OPG也能够抑制巨噬细胞破骨分化[27]。这表明，Irisin不仅能够促进成骨分化，而且可能抑制破骨分化。研究显示，IL-1β是Runx2的负调控因子，IL-1β的高表达能够抑制Runx2的转录活动，进一步影响骨骼形成[28];下调IL-6能够上调成骨标志基因，促进骨修复[29]。本研究显示，在骨组织和BMSC中，DOP模型鼠Runx2表达量显著降低，炎症因子IL-1β、IL-6显著升高，可能是高血糖环境激活了炎症因子的表达，进一步抑制了成骨标志基因的表达；外源性Irisin治疗后，炎症因子的表达被显著抑制，挽救了成骨标志因子Runx2的表达。

在健康小鼠体内，外源性Irisin对皮质骨及其力学性能有积极作用，增加皮质参数，如组织矿物质密度、皮质骨表面、骨周长和长骨抗扭转指数。在“后肢悬吊”小鼠中，重组Irisin治疗4周后，皮质骨密度和松质骨骨密度恢复[30]。根据Kim等[9]的研究，长期低水平的循环Irisin可导致骨转换加快，而低剂量和间歇性的鸢尾素补充治疗，可能会促进骨的合成。研究证实，Irisin能够抑制骨细胞的凋亡，促进骨细胞的存活[31]。鉴于骨细胞属于终末细胞，在体内不分裂或进一步分化，骨细胞的存活能够继续维持骨量。本研究显示，在松质骨中，DOP模型鼠骨微细结构明显破坏，外源性Irisin治疗后，骨小梁表面成骨细胞数量增加，骨微细结构得到改善。

综上所述，DOP小鼠循环Irisin会显著降低，骨组织及BMSC炎症因子表达量显著升高，并出现骨微细结构破坏；Irisin治疗后，循环Irisin升高，空腹血糖降低，骨微细结构改善，可能机制是通过抑制炎症因子的表达促进成骨分化。因此，外源性Irisin补充治疗可能可以有效地防治DOP。

参考文献:

[10]时超楠,李雪梓,刘玲玲.绝经后妇女血清鸢尾素与骨密度和骨代谢的相关性研究[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(8):1125-1128.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2021D01C213);

文章来源:田峰,涂来勇,张恩丰,等.鸢尾素抑制炎症因子表达促成骨分化改善糖尿病小鼠骨代谢的研究[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(04):511-516.