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Ⅰ型骨质疏松症患者长链非编码RNA WT1-AS与骨密度关系

2024-06-25 6 上传者：管理员

摘要：目的　探讨Ⅰ型骨质疏松症(OP)患者血清长链非编码RNA(lncRNA)WT1-AS水平与骨密度(BMD)及骨代谢指标的相关性。方法纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组)，同期绝经后骨量减少者114例(骨量减少组)以及同期年龄相符的绝经后非OP女性120例(对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定研究对象血清lncRNA WT1-AS水平，采用酶联免疫法测定骨代谢指标，包括血清骨钙素(OCN)、β-胶原降解产物(β-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)。采用Pearson法分析OP患者血清lncRNA WT1-AS与BMD及骨代谢指标相关性，采用logistic回归法分析影响OP发生的因素；采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达，观察lncRNA WT1-AS对前成骨细胞分化和矿化的作用。结果与对照组和骨量减少组相比，OP组OCN水平降低，β-CTX、PINP水平和lncRNA WT1-AS相对表达量升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD(L1～4和股骨颈)、OCN水平呈负相关(r=-0.542、-0.557、-0.608)，与β-CTX、PINP水平呈正相关(r=0.576、0.595)。血清lncRNA WT1-AS水平是影响OP发生的危险因素。血清lncRNA WT1-AS水平诊断OP的ROC曲线下面积(AUC)为0.796，特异度为92.11%，灵敏度为62.96%。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达，可促进矿化结节生成。结论 Ⅰ型OP患者血清lncRNA WT1-AS异常高表达与BMD、骨代谢有关，且影响Ⅰ型OP的发生，对OP具有一定的诊断价值。

关键词：
OP
RNA
WT1蛋白质
长链非编码
骨质疏松
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骨质疏松症(OP)是多因素导致的骨微结构破损、骨密度(BMD)降低、骨脆性增加的全身性骨病[1]。Ⅰ型OP患者具有疼痛加重、行动受限、脊柱变形、易骨折等症状，给患者、家庭、社会造成沉重的负担[2]。临床中BMD检测是反映骨头状态的有效方式[3]。骨代谢指标可反映骨吸收与骨形成的关系，与BMD存在密切联系[4]，骨钙素(OCN)、β-胶原降解产物(β-CTX)、Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)是常用的骨代谢指标。分子生物学为OP的机制研究及疾病预测提供了新的方式，寻求方式简单、结果高效的血清学指标是研究的热点。多项研究[5,6]显示，长链非编码RNA(lncRNA)可通过调控成骨分化相关信号通路参与OP的进展。lncRNA WT1-AS是一种功能性lncRNA，其可参与对PI3K、p53通路的调控[7,8]，而PI3K、p53等通路在OP的骨代谢中发挥作用[9,10]。Wang等[11]的研究显示，lncRNA WT1-AS在OP患者中上调，且与p53表达呈正相关，与p53相互作用调节成骨细胞的凋亡。lncRNA WT1-AS在OP患者中表达水平发生变化，但其在Ⅰ型OP患者中与骨代谢及BMD的相关性证据仍欠缺。本研究分析了绝经期女性OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD和骨代谢的关系，为血清lncRNA WT1-AS在OP发展中的作用提供证据。

1、资料与方法

1.1 一般资料

纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组)，纳入标准：①闭经1年及以上[12]；②股骨颈或腰椎BMD T值<-2.5；③1个月内未服用钙剂、维生素D、激素类药物；④患者心、肝、脾、肺等多脏器无功能异常。排除标准：①合并恶性肿瘤；②近3个月内发生骨折；③合并甲状旁腺疾病、肾上腺疾病等可能影响骨代谢的疾病；④合并神经系统疾病。纳入同期绝经后骨量减少者114例(骨量减少组)以及同期年龄相符的绝经后非OP女性120例(对照组)。记录研究对象身高、体质量，计算体质量指数(BMI)，采用X线骨密度仪测量L1～4(取平均值)、股骨颈处BMD。3组研究对象一般资料差异无统计学意义(P > 0.05，表1)，具有可比性。本研究经过恩施土家族苗族自治州中心医院伦理委员会审核备案。

表1 一般资料

1.2 方法

1.2.1 骨代谢指标测定

3组研究对象均抽取空腹静脉血5 mL，离心得上清液，采用酶联免疫法测定血清OCN、β-CTX、PINP水平。OCN ELISA试剂盒(ml058528)、人β-CTX ELISA试剂盒(ml038555)和人PINP ELISA试剂盒(ml038554)均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2.2 沉默前成骨细胞中的lncRNA WT1-AS的表达

小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1购自中国科学院细胞库。MC3T3-E1细胞培养在质量浓度为0.10 g/mL的胎牛血清和质量浓度为0.01 g/mL的双抗α-MEM中生长，3 d更换一次成骨培养基(含0.10 g/mL FBS，0.10 μmol/L地塞米松，10.00 mmol/L β-甘油磷酸酯，50.00 μmol/L抗坏血酸，60.00 μg/mL青霉素和100.00 μg/mL链霉素)，在37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱中生长，当细胞达到80%融合，使用胰蛋白酶将细胞消化传代，取对数生长期细胞，使用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA和lncRNA WT1-AS siRNA转染至细胞中，转染48 h，并记为siRNA组和lncRNA WT1-AS siRNA组，并与未转染细胞(未转染组)进行比较。各组细胞继续使用成骨培养基培养，诱导细胞分化14 d，检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活力水平，ALP检测试剂盒(P0321S)购自上海碧云天生物技术有限公司；使用质量浓度为0.04 g/mL的多聚甲醛固定细胞1 h，然后加入茜素红染液在室温下染色15 min，显微镜下观察钙结节形成情况，加入质量浓度为0.10 g/mL的乙酸提取染色，酶标仪测量562 nm处的吸光度[13]。

1.2.3 血清及细胞lncRNA WT1-AS水平测定

提取各组血清及各组细胞总RNA 5 μg，反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM进行扩增，内参选用GAPDH基因，lncRNA WT1-AS、GAPDH引物序列见表2，由上海生工生物工程股份有限公司构建。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)条件为：95℃，10 min；40个PCR循环(95℃，10 s；55℃，20 s；72℃，15 s)。2-ΔΔCt法计算lncRNA WT1-AS相对表达量[14]。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以

±s表示，多组间比较采用F检验，进一步比较采用SNK-Q检验；采用Pearson法分析OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD及骨代谢指标相关性；采用logistic回归法分析影响OP发生的因素；采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2、结果

与对照组和骨量减少组相比，OP组OCN水平降低，β-CTX、PINP水平及lncRNA WT1-AS相对表达量升高，差异均有统计学意义(P < 0.05，表3)。OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD(L1～4和股骨颈)、OCN水平呈负相关(r=-0.542、-0.557、-0.608，表4)，与β-CTX、PINP水平呈正相关(r=0.576、0.595，表4)。Logistics回归分析结果显示，血清lncRNA WT1-AS水平是影响OP发生的危险因素(比值比为3.158，P < 0.05)。血清lncRNA WT1-AS水平诊断OP的曲线下面积(AUC)为0.796(95%置信区间0.734 ～ 0.857)，特异度为92.11%，灵敏度为62.96%(图1)。

细胞实验结果显示，与未转染组和si RNA组相比，lncRNA WT1-AS si RNA组lncRNA WT1-AS相对表达量降低，ALP活性和相对吸光度升高，钙结节增加，差异均有统计学意义(P < 0.05，表5，图2)，对照组与si RNA组差异无统计学意义(P > 0.05，表5，图2)。

表3 各组统计指标

表4 各因子与OP患者血清lncRNA WT1-AS水平的相关性

表5 沉默lncRNA WT1-AS对成骨细胞分化的影响

图2 茜素红染色观察钙结节（×100)

3、讨论

OP是骨代谢异常造成骨流失、BMD降低的疾病。骨吸收与骨形成的失衡是OP发生的重要原因[15]。绝经后妇女由于激素水平异常，会影响骨吸收与骨形成间的平衡，OP发生率较高。BMD检测是临床判定骨质疏松的重要方法，但BMD改变具有滞后性，无法为早期OP的判定提供帮助[3]。骨代谢是骨吸收与骨形成的基础，OCN主要由成骨细胞合成，可调节骨代谢，对OP的诊断具有重要价值；β-CTX可反映破骨细胞骨吸收的程度；PINP可作为检测骨胶原合成情况的指标[16]。本研究基于BMD、OCN、β-CTX、PINP与OP的密切关系，寻找与OP密切相关的分子生物学指标，为早期预测OP的发生提供依据。

lncRNA参与多种生物学过程，近年来关于lncRNA在骨代谢中的研究逐渐增多。史正亮等[5]的研究显示，lncRNA ANCR可刺激OP大鼠脂肪原型干细胞的成骨分化，机制可能为参与对Wnt信号通路的调控。Zhang等[17]的研究显示，lncRNA XIXT靶向作用于骨髓间充质干细胞促进成骨分化，缓解OP进展。lncRNA WT1-AS可编码锌指结构域，在恶性肿瘤中对其研究较多[18,19]，在骨代谢中对其研究较少。Wang等[11]的研究显示，lncRNA WT1-AS可与p53相互作用调节成骨细胞的凋亡，表现为OP患者中上调。lncRNA WT1-AS可参与对转化生长因子-β1(TGF-β1)的调控[20]，而TGF-β1在骨组织中含量丰富，可促进骨细胞分化[21]。Wu等[7]的研究显示，lncRNA WT1-AS可参与对PI3K/akt通路的调控、促进非小细胞肺癌的进展，而PI3K/akt在调控成骨细胞分化中同样发挥作用[22,23]。本研究中，OP组血清lncRNA WT1-AS水平显著高于骨量减少组和对照组，且骨量减少组与对照组间lncRNA WT1-AS水平也有差异，提示lncRNA WT1-AS水平可能与OP的进展有关。为进一步分析血清lncRNA WT1-AS水平与OP的关系，本研究对OP组血清lncRNA WT1-AS水平与BMD、OCN、β-CTX、PINP水平的相关性进行了分析，发现lncRNA WT1-AS水平与BMD呈负相关，且lncRNA WT1-AS水平与OCN水平呈负相关，与β-CTX、PINP水平呈正相关，提示lncRNA WT1-AS可能与骨形成降低及骨吸收增强有关，即lncRNA WT1-AS可能通过参与对骨吸收、骨形成的平衡调控影响OP进展。本研究ROC曲线分析结果显示lncRNA WT1-AS对OP具有一定的诊断价值，且体内细胞实验结果显示，沉默lncRNA WT1-AS表达能促进前成骨细胞分化和矿化，提示lncRNA WT1-AS可能参与OP的进展，lncRNA WT1-AS有望成为OP治疗的作用靶点。

综上所述，OP患者血清lncRNA WT1-AS水平异常升高，与患者BMD下降及骨代谢指标改变密切相关，对OP具有一定的诊断价值。但本研究也存在一定不足，仅从临床样本中分析了血清lncRNA WT1-AS与BMD和骨代谢指标的相关性，初步通过细胞实验验证lncRNA WT1-AS在成骨细胞中的作用；且骨赘的形成可能对BMD的测定结果产生一定影响，造成数据偏移。未来，本研究组将继续通过体外细胞实验和体内动物实验分析lncRNA WT1-AS对OP相关通路的调控及与OP发生机制的关系。

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