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环境DNA技术在湖泊生物多样性研究中的运用分析

2024-11-14 53 上传者：管理员

摘要：本文对环境DNA技术在湖泊生物多样性研究中的应用进行综述，包括样品采集、DNA提取、物种检测，以及多样性监测等方面。并结合现有研究案例，探讨了环境DNA技术在提高物种检测准确性、监测稀有物种等方面的优势。

关键词：
水生生态系统
浮游生物
湖泊
环境DNA
生物多样性
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1、环境DNA技术应用背景

水生生态系统的生物多样性极其丰富，但传统调查手段在面对微小、稀有或生长阶段差异明显的物种时，往往捉襟见肘，难以有效获取科学数据。尤其是在湖泊资源调查中，这些问题尤为突出。针对浮游生物，现有方法通常采用特制网具进行捕捞和浓缩，然后再进行识别。然而，这种方法不仅操作烦琐，而且容易造成样品损伤，影响鉴定精度。对于鱼类调查的传统手段包括网捕、诱捕、声呐探测以及现场调查等。然而，这些方法要么效率低下，要么成本高昂，难以大规模应用。而底栖生物的调查则主要依靠泥样采集器和底拖网等工具，但这些工具对环境的扰动较大，且样品处理过程烦琐，耗时长。环境DNA技术的出现，为上述难题提供了新的解决方案。环境DNA技术通过分析水体中存在的DNA碎片——这些碎片来自生物的黏液、表皮、死亡细胞等，能够在不直接捕获生物的情况下，准确地识别出水体中存在的生物种类。这种技术具有高度的特异性和灵敏度，能够有效地监测到特定物种，从而克服传统方法的多项限制。通过直接从环境样本中提取DNA，然后进行扩增和高通量测序，能够提供关于样本中存在的多个物种的详细信息。该技术已经在生物多样性评估、群落结构研究以及资源评价等多个领域得到应用。

2、环境DNA技术研究湖泊生物多样性的实验设计

2.1环境DNA技术在湖泊生物多样性研究中的样品采集和保存技术

样本采集与保存是湖泊生物多样性环境DNA研究的关键步骤，直接影响着研究结果的准确性和可靠性。目前，常用的环境DNA样本采集与保存技术包括过滤法、沉淀法和离心法。过滤法是利用滤器截留水体中的环境DNA，是最常用的环境DNA采集技术。操作时，将水体样本通过滤器，环境DNA会被吸附在滤纸上，实现环境DNA的收集和浓缩。过滤法的优点是操作简单、效率高、成本低，但滤膜的选择和操作过程中的污染控制对环境DNA的提取效率和质量有较大影响。沉淀法是利用乙酸钠和无水乙醇等化学试剂诱导环境DNA沉淀，从而进行收集和保存。具体操作是向水体样本中加入一定比例的乙酸钠和无水乙醇，使环境DNA发生沉淀，然后收集沉淀物进行后续分析。沉淀法的优点是操作简单、成本低，但可能会导致环境DNA降解和损失。离心法是利用离心力将环境DNA从水体样本中分离出来。具体操作是将水体样本放入离心管中，高速离心后，环境DNA会沉积在离心管底部，收集沉淀物进行后续分析。离心法的优点是采集效率高、环境DNA损失少，但需要专用的离心设备，操作成本相对较高[1]。

2.2从湖泊样本中提取环境DNA的策略

提取环境DNA的过程旨在从湖泊样本中分离出DNA，这包括从细胞及其组成部分中释放DNA以及有效去除可能影响PCR反应的干扰物，如腐殖质和腐殖素。面对环境样本中生物成分的高度复杂性，有效地提取DNA是研究者们遇到的一个主要难题。在进行环境DNA提取时，研究的重点集中在两个方面：首先是尽可能多地回收环境DNA；其次是最小化干扰因素（例如样本中的蛋白质复合物和腐殖素等）的影响[2]。

环境DNA的提取策略包括自制配方和市售试剂盒，选择最适合的方法至关重要。在提取环境样本DNA的早期研究中，根据目标生物的不同，酚氯仿提取法（PCI法）常被采用。例如，Ochsenreiter等人在研究高盐湖泊古细菌多样性时，通过过滤、裂解液处理和蛋白酶K处理样本，成功使用PCI法提取DNA[3]。尽管许多环境DNA研究仍采用PCI法，但考虑到其涉及对人体有害的化学物质（如苯酚和氯仿），操作和废弃物处理需格外小心。相比之下，使用商业试剂盒进行环境DNA提取更为推荐，因为它们既安全又有效。

2.3在湖泊样本中进行环境DNA的识别与分析

环境DNA的识别和分析，特别是针对特定生物种类或分类群，主要依赖于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术利用特定引物来识别物种。通常，线粒体DNA片段因其高拷贝数和物种识别的保守序列而成为首选，用于湖泊生物的识别；相反，由于核DNA的检测灵敏度较低，它在环境DNA识别中的应用较为有限。常见的线粒体基因包括细胞色素b(Cytb）、氧化酶亚单位I(COI）、12S rRNA、16S rRNA、D-loop等。目标DNA片段的长度通常设定在80到200碱基对之间。特异性引物的设计基于目标物种或分类群的特定线粒体DNA序列，同时需要满足高通量测序技术的片段长度要求，并具备区分近缘物种的能力[4]。

在湖泊特定物种或分类群的环境DNA检测中，常用的技术方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时定量PCR(qPCR）和微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR）。PCR作为广泛应用的技术，能够进行目标物种的定性分析，但通过电泳结果的亮度估计环境DNA的浓度并不精确，并且存在污染风险。相比之下，qPCR提供了更高的特异性和敏感性，已成为环境DNA研究的主要定量工具，适用于生物多样性评估和种群密度分析等需要高精度定量的场合。ddPCR作为一种直接定量环境DNA目标片段拷贝数的技术，其优势在于不受DNA浓度和PCR抑制因素的影响。因此，ddPCR可以作为q PCR的补充或替代方法，用于环境DNA的定量分析。

PCR的目的是指数级地增加特定DNA片段的拷贝数。假设每个循环都成功地扩增目标DNA，经过n循环的扩增后，目标DNA的拷贝数可以用以下公式计算：

式中：N是最终的DNA拷贝数，N0是初始的DNA拷贝数，n是PCR循环的次数。

qPCR技术通过实时监测荧光信号的增加来量化DNA模板的初始量。该过程中一个关键参数是阈值循环（Ct），它表示达到检测阈值所需的循环次数。初始DNA量与Ct值呈负相关，可用以下公式描述：

式中：N0是初始的DNA拷贝数，N是检测阈值时的DNA拷贝数，Ct是达到阈值的循环次数。

dd PCR技术通过分割样本到成千上万个微滴，并在每个微滴中独立进行PCR，以直接计算DNA片段的拷贝数。假设每个微滴只包含0或1个DNA模板分子，目标DNA的总拷贝数可以通过以下公式估算：

式中：N是总的DNA拷贝数，p是呈阳性反应的微滴比例，Vtotal是总反应体积。

环境DNA宏条形码技术，得益于高通量测序（HTS）技术的进步，为多样的生物群体提供了一种检测手段。随着宏条形码技术的兴起，其在生物多样性丰富的环境中尤为适用于进行环境DNA研究。利用DNA宏条形码，物种的识别变得更加迅速、精确和自动化。

3、环境DNA技术在湖泊生物资源研究中的应用

3.1环境DNA技术在物种监测中的应用

环境DNA技术已广泛应用于湖泊生物多样性调查、外来物种追踪和濒危稀有物种保护。生物入侵威胁原生物种，破坏入侵区域生态系统功能，导致生态退化和物种灭绝。这凸显了追踪侵入物种的重要性。浮游生物、鲤鱼、河鲈、克氏原螯虾、淡水珍珠贻贝等湖泊生物，都可通过环境DNA技术进行监测。2008年，Ficetola等人利用特异性引物在湖泊样本中成功检测到牛蛙DNA，开启了环境DNA技术监测侵入物种的先河[5]。

环境DNA领域在中国起步较晚。2005年起，中国学者开始研究土壤环境DNA的提取与纯化。2014年，王晓辉等人研究了海洋底泥环境DNA的提取方法，为环境DNA技术在水生环境的应用奠定了基础[6]。目前，利用环境DNA技术调查浮游生物和底栖生物的研究尚不充分，但已开展了针对江豚、鲟鱼等特定物种的监测研究。湖泊等水域的特殊生态环境使得传统监测方法难以应用于某些物种，特别是濒危和稀有物种。传统监测方法通常速度慢、准确性低，难以提供实时数据，对紧急保护措施的实施造成障碍。环境DNA技术的引入有效克服了这些限制，对生态和物种研究更加友好，允许通过分析水样中的环境DNA迅速获取物种信息、分布和丰度数据。环境DNA技术具有灵敏度高、成本低、效率高等优点，在水体生物多样性调查、外来物种入侵监测、濒危物种保护等方面具有广阔的应用前景。

3.2采用环境DNA监控生态多样性

人类活动，如过度捕捞、栖息地破坏和外来物种入侵，对湖泊生态系统生物多样性结构造成了显著影响。尽管已采取了一系列保护措施，但效果却不佳。传统的生物多样性监测方法，包括潜水调查、声呐技术和拖网捕捞，不仅耗时费力，而且操作难度大。环境DNA技术的出现，为快速、准确地监测生物多样性变化提供了一种创新方法。该技术已应用于地形复杂、难以进行传统采样的区域。而在湖泊生态系统中，鱼类作为最多样化的脊椎动物群体，对评估水域生态健康状况具有重要的指标意义。例如，2012年，Thomsen等人在丹麦温带海洋生态系统中利用环境DNA技术开展了鱼类多样性研究[7]。研究对比了环境DNA结果与传统浮潜、拖网和围网捕捞等方法，结果表明，考虑到海洋地形和专业知识的限制，环境DNA技术提供了更加客观可靠的数据。此后，研究领域拓展至淡水湖泊和河流，学者们探究了环境DNA技术在监测水生生物多样性方面的应用，并将其应用于新的环境。在2018年，Anaïs团队在北极地区利用环境DNA宏条形码技术开展了大范围的生物多样性监测，识别出181种物种[8]。研究同时分析了环境DNA在不同水深、潮汐和季节中的时空分布情况。研究强调，环境DNA采样需考虑空间和时间维度因素，以确保群落结构评估的准确性。

3.3生物量的环境DNA测定

水生生态监测的关键内容之一是评估特定水域中生物资源的丰度。其中，测量环境DNA浓度是一种有效手段，可以用来估计特定区域内目标生物的生物量。研究表明，物种密度与环境DNA浓度呈正相关关系，由此可见，通过分析环境DNA浓度可以推测物种生物量。例如，每升水中的环境DNA浓度大约为1000拷贝，与该区域内该物种的估计密度为5个个体/平方米正相关。这表明，通过环境DNA浓度的定量分析，可以相对准确地推测出特定区域内目标生物的丰度。通常通过在人工控制条件下测量特定物种的密度，并与相应的环境DNA浓度进行比较，建立密度与环境DNA浓度之间的关联曲线来验证这种关系。虽然该方法对环境DNA浓度与物种数量呈强相关性生物有一定适用性，但其应用范围有限。例如，对于虾类和贝类等具有硬质外壳的生物，环境DNA浓度与其生物量之间的关系可能并不直接或明确。值得注意的是，基于环境DNA浓度的生物量评估不仅局限于数量分析，还可以拓展至生物种群遗传多样性分析领域。通过该方法，不仅可以评估物种数量和结构的差异，还可以对物种优良遗传特性的稳定性进行分析，提供新的见解。

4、结语

总之，环境DNA技术在湖泊生物多样性研究中的应用日益广泛，其发展与应用前景广阔。本文以环境DNA技术在湖泊生物多样性监测中的应用为例，探讨了其作为高效、精确生物监测工具的潜力。展望未来，随着分析方法的优化和技术的不断进步，环境DNA技术将在生态保护、物种多样性评估和环境监测等领域发挥更为重要的作用。

参考文献:

[1]郭婷,付智豪,周春花,等.基于环境DNA宏条形码的鄱阳湖真核浮游植物多样性研究[J].水生态学杂志,2023,44(5):67-75.

[2]唐诗琴,王庆,刘璐,等.基于环境DNA宏条形码技术的水体无脊椎动物多样性研究:以广州海珠湖为例[J].湖泊科学,2023,35(4):1443-1456.

[4]杨海乐,张辉,杜浩.eDNA监测方法标准化框架及未来图景[J].湖泊科学.2023,35(1).

[5]王汝贤,杨刚,耿智,等.环境DNA技术在长江口鱼类多样性分析中的应用[J].水生生物学报.2023,47(3).

[6]王晓辉,黄李淑馨,白凤武,杜昱光.海洋底泥环境DNA提取与纯化方法比较研究[J].大连理工大学学报,2014,54(3):272-277.

文章来源:张丹薇,王宁.环境DNA技术在湖泊生物多样性研究中的运用分析[J].黑龙江环境通报,2024,37(11):163-165.