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鸭坦布苏病毒感染诱导禽巨噬细胞M1型极化

2023-11-13 142 上传者：管理员

摘要：鸭坦布苏病毒（DTMUV）自2010年4月暴发以来，给全球养鸭业带来了巨大的经济损失。巨噬细胞作为关键的免疫细胞，其不同功能的极化表型对宿主的免疫反应和抗微生物感染非常重要。禽巨噬细胞作为DTMUV感染的关键靶细胞，本研究通过荧光定量PCR、亚硝酸盐实验等对DTMUV感染禽巨噬细胞HD11后的极化表型进行分析。结果表明，DTMUV感染后能显著诱导HD11细胞发生M1型极化，刺激产生大量的促炎细胞因子。

关键词：
M1型极化
微生物感染
禽巨噬细胞
细胞因子
鸭坦布苏病毒
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随着规模化养鸭场的迅速扩张，鸭传染病的发病率越来越高，这不仅损害了养鸭业的发展，而且部分疾病还可能会对公共健康造成一定威胁[1]。鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）自2010年暴发以来，该病已经成为严重危害养鸭业的重大疫病之一。DTMUV感染产蛋鸭，导致卵巢出血，产蛋量急剧下降，它还会导致雏鸭发热、生长迟缓和神经症状[2]。有报道显示，养殖场工作人员可携带DTMUV抗体，且该病毒可感染人神经细胞，因此，深入研究该病的致病机制，不仅有利于保障养鸭业的健康发展，还具有非常重要的公共卫生意义[3]。

巨噬细胞是广泛分布于全身血液和组织的免疫细胞，作为抵抗微生物感染的第一道防线之一，它们通过分泌大量的细胞因子来促进和协调宿主免疫[4]。极化对巨噬细胞的生物功能至关重要，而巨噬细胞极化在炎症发展中非常重要。在不同外界刺激下，巨噬细胞极化可分为两种类型：经典激活的巨噬细胞（M1）和交替激活的巨噬细胞（M2）。M1型巨噬细胞可产生大量促炎症细胞因子，如TNFα、IL-6、CXCL-8和IL-1β，在促炎症、组织损伤、抗肿瘤和防腐方面起作用，主要参与Th1型免疫反应。M2巨噬细胞主要参与Th2型免疫反应，发挥抗炎、组织修复和免疫调节作用[5]。

1、材料与方法

1.1 细胞和病毒

鸡骨髓巨噬细胞系HD11由上海诺莱生物技术有限公司提供。DTMUV FX2010株（登录号：MH414568.1）在BHK-21细胞上进行增殖，并收集细胞上清用于后续实验。

1.2 荧光定量PCR(q PCR)

用Trizol(Ta Ka Ra，大连，中国）提取细胞样本总RNA。使用Hi Script®III RT Super Mix for q PCR(+g DNA wiper)kit（诺唯赞，南京，中国）将100μg的总RNA逆转录成c DNA用于后续实验。使用表1中的引物进行q PCR反应。q PCR的体系为20μL，具体包括1μL c DNA(25 ng），上下游引物（10μM）各0.4μL,10μL SYBR Green和3.2μL无菌水。反应条件为：95℃30 s一个循环，然后40个循环95℃5 s和60℃30 s。

1.3 亚硝酸盐检测

用Griess方法检测细胞培养上清液中的亚硝酸盐（M1巨噬细胞产生的一氧化氮的稳定代谢物）的浓度。在本实验中，细胞上清液中的一氧化氮浓度是用一氧化氮检测试剂盒（Beyotime，上海，中国）测定。首先，取出Griess试剂I和II让其恢复到室温。将标准物质（1～100μM）用含10%FBS的RPMI1640细胞培养基稀释。然后将标准物质和对照细胞培养上清液以50μL/孔加入96孔板中。在有样品的孔中以50μL/孔加入Griess Reagent I，在每个孔中以50μL/孔加入Griess Reagent II。依次加入96孔板后，静置10 min，用酶标仪在540 nm处测量吸光度。根据标准曲线计算样品中一氧化氮的浓度。

表1 引物序列

1.4 流式细胞术

M1型HD11巨噬细胞的细胞表面分子用FITC结合的抗鸡MHC-II抗体（abcam，英国）染色。用胰蛋白酶消化后收集细胞，然后用5%血清阻断，使用抗体（1:500，批号ab24882）避光孵化，每一步前后样品经PBS洗涤，最后用500μL PBS重新悬浮细胞，并立即用LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences，美国）进行检测。使用Flow Jo软件（BD Biosciences，美国）对结果进行分析。

1.5 统计分析

q PCR数据使用2-ΔΔct方法进行分析。从三个独立实验中获得的数据以平均值±标准差（MEAN±SD）表示。使用Graph Pad Prism 5.0(Graph Pad Software,San Diego,CA）进行数据的统计与作图。两组数据通过student’s t检验进行差异性分析。*P<0.05和**P<0.01分别表示差异显著和极显著。

2、结果

2.1 q PCR检测DTMUV感染后对HD11巨噬细胞极化的影响

通过q PCR检测接毒和LPS处理后不同时间点对HD11巨噬细胞极化的影响，发现DTMUV感染巨噬细胞后对M1型巨噬细胞极化标志因子，包括CXCL-8、IL-1β、i NOS、CD86等具有显著诱导作用，并且上调倍数高达1 500多倍，而对M2型极化标志因子，如IL-10、IL-4、CD206等激活作用较弱。结果初步表明，DTMUV感染诱导HD11巨噬细胞发生M1型极化（图1）。

2.2 M1型巨噬细胞极化关键因子i NOS的检测

通过2.1的结果分析表明，DTMUV主要引起HD11巨噬细胞发生M1型极化，所以进一步验证DTMUV感染后对M1型巨噬细胞极化关键因子i NOS的影响。由于一氧化氮并不稳定，其会代谢为亚硝酸盐，所以对亚硝酸盐的浓度进行检测。结果表明，DTMUV感染HD11巨噬细胞后亚硝酸盐浓度显著升高（图2）。

2.3 M1型巨噬细胞关键因子MHC-Ⅱ的检测

通过流式细胞术进一步检测DTMUV感染后对M1型巨噬细胞极化相关特征因子MHC-Ⅱ的影响。结果发现，在DTMUV感染后3 h就显著激活MHC-II的表达，表明病毒能有效激活禽巨噬细胞的M1型极化。

图1 q PCR检测接毒后HD11细胞M1和M2极化相关因子

图2 DTMUV感染HD11巨噬细胞后亚硝酸盐浓度检测

3、讨论与结论

多项研究报道，禽巨噬细胞是DTMUV感染的关键靶细胞，被感染的巨噬细胞对DTMUV的复制、传播和致病机制至关重要[6]。此外，巨噬细胞在病毒感染情况下会发挥不同功能作用，不仅有利于抵抗病毒，还有可能促进病毒复制和传播[7]。特别是病毒感染后激活M1型巨噬细胞极化，可能引起细胞因子风暴，对宿主造成炎症损害[8]。首先通过荧光定量PCR检测了DTMUV感染后对M1和M2巨噬细胞极化相关因子的影响，发现DTMUV感染HD11巨噬细胞后主要激活M1型极化相关因子的表达。文献报道，亚硝酸浓度检测可以作为极化检测标准[9]，通过亚硝酸检测试剂盒进一步检测了DTMUV感染HD11巨噬细胞后亚硝酸盐的含量，发现病毒感染显著升高了亚硝酸盐浓度，因亚硝酸盐是一氧化氮的稳定代谢物，因此亚硝酸盐浓度的检测作为M1型巨噬细胞检测指标，亚硝酸盐浓度的升高表明，DTMUV感染后显著诱导M1型巨噬细胞极化。MHC-Ⅱ是巨噬细胞极化后激活产生的细胞表面因子[10]，通过流式细胞术检测MHC-Ⅱ的表达，发现DTMUV感染HD11细胞后从3 h就显著诱导MHC-Ⅱ的表达。

综合上述结果分析表明，鸭坦布苏病毒感染HD11细胞后3 h就可以诱导巨噬细胞发生M1型功能极化，并产生大量炎性因子，为后续实验阐明极化分子机制鉴定基础。

文章来源:耿宁蔚,郭志云,吕泽昊等.鸭坦布苏病毒感染诱导禽巨噬细胞M1型极化[J].山东畜牧兽医,2023,44(11):20-23.