慢性难愈合伤口是临床常见的一种病理过程，包括压力性溃疡、糖尿病足溃疡、静脉性溃疡、外伤所形成的肉芽创面损伤、烧伤或烫伤创面等，给患者身体、心理和经济上都带来了巨大负担[1]。多种因素均会造成伤口愈合缓慢或延迟，究其原因为炎症期未能有效向增殖期转归。所以调控伤口愈合炎症反应可用于指导临床开发新颖的愈合疗法[2]。伤口愈合是一个复杂的生物学过程，由多种细胞和分子参与[3]。其中，巨噬细胞在组织再生和伤口愈合过程中扮演重要的作用。随着对巨噬细胞的不断深入研究，人们勾勒出了一幅巨噬细胞个体发育和功能的复杂画面。根据起源、功能和所产生的信号分子，人们把巨噬细胞归属为几个独特的类别[4,5]。在该综述中，我们介绍了巨噬细胞的不同分型，以及它们在伤口愈合和组织再生过程中的调控作用。同时也介绍了一些调控巨噬细胞极化分型，促进伤口愈合的新方法和活性化合物。

1、伤口愈合生理和病理过程

伤口形成后，会引起一系列连续又相互交错的事件：a.止血期；b.炎症期；c.增殖期；d.重塑期。止血期主要包括血小板血栓的形成和血管的收缩，限制出血，同时为新迁移的细胞形成一个支撑平台。止血期释放的趋化因子吸引炎症细胞，刺激驻地免疫细胞，两者一起启动伤口愈合的炎症期，此过程主要依赖于巨噬细胞。自此，巨噬细胞及其分泌的细胞因子开始在创伤愈合的炎症期、组织增生期和成熟重塑期发挥中心调控作用。伤口愈合增殖期主要依赖于成纤维细胞和巨噬细胞的功能，包括血管的新生、胶原的沉积和肉芽组织的形成。最后的伤口重塑期部分恢复组织的初始结构，以凋亡的方式清除多余的血管。该时期依赖于多种细胞类型的参与，例如巨噬细胞通过释放基质金属蛋白酶(MMPs),参与细胞外基质的消化和重构[6,7]。许多疾病，例如糖尿病和血管病变，会导致伤口愈合迟缓和慢性伤口的形成。这些伤口不能按照正常的愈合程序向前推进，无法进入伤口愈合的修复期。相反，持续停留在巨噬细胞介导的炎症期[2,8]。

2、巨噬细胞个体发育和伤口巨噬细胞的来源

成年哺乳动物巨噬细胞有两个不同的来源：胚胎外卵黄囊和血液单核细胞。细胞原基分布图和巨噬细胞敲除实验均显示，在小鼠早期妊娠期(胚胎发育6.5～8.5d),卵黄囊会生成红髓祖细胞(erythro-myeloidprogenitorcells,EMPs)的一个亚群，继而参与克隆分化为胚胎器官，成为组织驻地巨噬细胞[9,10]。驻地巨噬细胞能实现自我更新，在给定的成年器官中，其数量能实现自我维持，不需要单核细胞的输入[11]。在稳定的环境下，驻地巨噬细胞充当侦察兵，维持机体的稳态。但是当感染或损伤发生时，它们会被刺激活化，发挥一定的免疫效应[12]。成年哺乳动物巨噬细胞另一个来源是循环血液单核细胞。单核细胞源自造血干细胞(HSCs),其位于胚胎形成时期的胚肝，成人的骨髓中[13]。当损伤形成后，血液/骨髓源的单核细胞被招募到伤口位点，在此转化为成熟的巨噬细胞。局部伤口巨噬细胞由源自单核细胞和组织驻地巨噬细胞两者所组成。尽管两类巨噬细胞间的相互合作程度以及对伤口愈合的相对输入目前还不是很清楚。但有研究显示，某些过程例如肝损伤纤维化，主要取决于循环血液中的单核细胞[14]。

3、单核细胞和巨噬细胞

至少有两种不同的单核细胞类型，它们在信号分子和到达伤口位点的时间顺序存在差异。第一种类型是炎性单核细胞：小鼠中低表达CX3CR1,高表达CCR2和Ly6C;人体中为CD14++CD16-。第二种类型：小鼠中高表达CX3CR1,低表达CCR2和Ly6C;人体中CD14低表达，CD16+。第一个到达伤口位点的是炎性单核细胞(CX3CR1low,CCR2high,Ly6Chigh),紧接着是CX3CR1high,CCR2low,Ly6Clow单核细胞[15,16]。CX3CR1是趋化因子配体CX3CL1的受体，分别是跨膜蛋白和趋化因子，参与免疫细胞的迁移。CCR2是单核细胞化学趋化蛋白CCL2的受体，CCL2是一种趋化因子，介导单核细胞的趋化性。Ly6C是一种14kD的细胞表面磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，表达于巨噬细胞前体。CX3CR1和CCR2两者对于伤口招募血液单核细胞是必不可少的。小鼠皮肤切除模型研究显示，CX3CR1敲除小鼠和野生型小鼠输入抗CX3CR1中和抗体会引起伤口愈合功能受损，造成的原因是巨噬细胞数量减少，胶原沉积降低和伤口血管新生受损[17]。小鼠肝损伤模型研究显示，CCR2敲除会引起单核细胞招募和胶原生成异常[14]。这些发现提示，靶向作用CX3CR1,可用于调控巨噬细胞到伤口位点的招募。

传统分类，将巨噬细胞分为三种表型和功能独特的类别；M0未激活型，M1促炎/抗菌表型，M2抗炎/促愈合/旁路活化型。M1和M2型巨噬细胞可分别在体外用IFNγ/LPS或IL-4/IL-13刺激形成。其中，M2型巨噬细胞可进一步分化为三种不同的功能亚群：M2a由IL-4/IL-13诱导产生，能够促进创伤愈合；M2b由免疫复合物和FcγR/TLR的激动剂刺激产生；M2c由IL-10、TGF-β或糖皮质激素诱导产生；M2b和M2c都具有免疫调节作用[18]。在啮齿类动物中，M1型巨噬细胞会生成标志性杀菌分子诱导性一氧化氮合酶(iNOS),而M2型巨噬细胞则生成精氨酸酶(Arg-1)[19]。精氨酸酶降解精氨酸为鸟氨酸，其为胶原成分脯氨酸的前体。M2型巨噬细胞被认为主要是负责胶原沉积/纤维化和组织修复[15,20]。然而，分离伤口巨噬细胞研究显示，人类M2巨噬细胞并不产生精氨酸酶[21],说明体内情况更加复杂。伤口巨噬细胞表现出复杂的表型，包括M1和M2特性，并随伤口修复进程而改变[20]。表一总结了M1和M2的差异。巨噬细胞在伤口愈合过程中的防御/炎症反应和重塑/成熟阶段伴演着多方面的作用。根据它们在伤口愈合过程中的功能，巨噬细胞可被分为三种不同的类别：促炎巨噬细胞，组织修复和抗炎巨噬细胞[22]。它们能够：吞噬杀灭细菌；产生多种蛋白酶消化坏死组织；吞噬清除细胞碎片，死亡细胞和坏死组织；产生趋化因子/生长因子，例如PDGF,TGF-β1,IGF-1和VEGF-α,促进细胞增殖和血管发育，促进细胞迁移和存活；吸引内皮细胞，促进血管新生；促进成纤维细胞分泌胶原和细胞外基质，为新生组织提供结构骨架；合成大量细胞外基质成分和基质重塑酶。

4、巨噬细胞与细胞增殖

研究表明，巨噬细胞会分泌多种趋化因子和生长因子，对伤口细胞增殖、血管新生和细胞外基质的形成具有重要调控作用。例如TGF-β能诱导ECM基因的表达，并抑制能够降解ECM的MMPs基因的活性。TGF-β还可通过丝裂原活化蛋白激酶，促进胶原蛋白合成[18]。此外，有研究也表明TGF-β对成纤维细胞分化成肌成纤维细胞具有直接影响。Gindele等通过原代人小气道上皮细胞建立了一种体外机械划痕损伤模型，主要用于模拟内皮细胞伤口愈合，研究巨噬细胞亚型在这个过程中的作用[23]。他们发现M1型巨噬细胞促进黏着斑激酶(FAK,为多蛋白结构-黏着斑的一部分，链接细胞外基质和细胞骨架)表达。M1和M2巨噬细胞还会诱导内皮细胞去分化。他们也发现，M2巨噬细胞不同亚型具有不同的表达轮廓：M2a巨噬细胞抑制细胞增殖和纤连蛋白的表达(可能通过维甲酸途径)。M2b和M2c巨噬细胞抑制纤连蛋白的沉积(可能是通过MMP表达)。这些结果提示，不同的巨噬细胞亚型对伤口愈合有不同的影响。YU等研究了激光切除前列腺后，巨噬细胞和维甲酸在伤口愈合中的作用[24]。他们发现，维甲酸治疗后增强M2抗炎型巨噬细胞的功能，促进间质细胞活化和血管新生。他们也发现，精氨酸酶1(Arg1)生成增加是M2抗炎型巨噬细胞的标志物。该研究表明，维甲酸可通过刺激巨噬细胞改善伤口愈合。Chaqour等在小鼠视网膜血管模型中，通过使用3D发芽试验方法，研究了脱落酸(ABA,一种植物激素，参与植物应激反应和植物芽休眠)对视网膜和胎儿血管新生的影响[25]。他们显示，ABA抑制血管的发育和再生，加速巨噬细胞诱导的胚胎血管程序性退化。同时也发现，ABA会影响巨噬细胞表型，促进促炎性M1巨噬细胞的形成，并表达抗血管生成分子。ABA能抑制血管新生，改变巨噬细胞表型，可用于管理伤口愈合中血管的增殖。

5、巨噬细胞吞噬功能与伤口愈合

MADSEN等开发了一种检测方法，可在体观察胶原转变，鉴定参与组织碎片吞噬和降解的相关细胞和分子类型[26]。他们发现，导入到小鼠真皮内的胶原蛋白会被M2样巨噬细胞吞噬，并通过溶酶体途径降解。敲除胶原蛋白受体，例如尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体相关蛋白(Endo180)或者甘露糖受体(Mrc1和Mrc2),可抑制胶原降解。该研究提示，M2样巨噬细胞可通过受体途径，内化胶原蛋白。伤口愈合过程中，胶原清除和转变对组织重塑至关重要。该信息可用于新颖的伤口愈合策略的开发。QI等在糖尿病伤口愈合中研究巨噬细胞功能。糖尿病伤口累积有大量的晚期糖基化终末产物(AGEs)。巨噬细胞表达高水平的AGEs受体RAGE。作者显示，局部应用抗RAGE抗体可改善糖尿病伤口愈合。阻断AGE-RAGE信号可诱导巨噬细胞表型从M1(促炎)向M2(促愈合)表型转变，增加巨噬细胞吞噬中性粒细胞的数量[27]。该研究显示，抑制AGE-RAGE信号通路能改善早期炎症阶段巨噬细胞功能/吞噬，促进伤口愈合。MAGATTI等在啮齿类动物伤口愈合模型中，研究了已应用于再生医学的人羊膜间充质细胞(hAMTCs)对单核细胞和巨噬细胞的影响[28]。他们发现hAMTCs和它们的条件培养液可诱导骨髓细胞和单核细胞分化为巨噬细胞。此外，M1型极化状态下的单核细胞在hAMTCs和条件培养液处理后，可向M2样表型转化。这些M2样巨噬细胞表达CD14,CD206,CD23,CD163和PM-2K,具有更高的吞噬活性，增加IL-10生成，降低促炎细胞因子的分泌。相反，M2极化状态下的单核细胞在hAMTCs和条件培养液处理后，仍保持M2型。但是，这些M2型细胞有更强的抗炎属性，低表达共刺激分子CD80,降低吞噬和炎性趋化因子的分泌。此外，该研究也显示暴露在条件培养液的巨噬细胞在伤口愈合模型中，能改善组织修复/再生。该研究提示，羊膜间充质细胞和释放的因子可潜在应用于伤口愈合中巨噬细胞表型和功能的调控。

6、巨噬细胞与基质重塑酶

不同巨噬细胞亚型所合成和分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)在伤口愈合过程中具有重要作用。ROCH等研究了人类巨噬细胞不同亚型(M0未极化巨噬细胞，M1促炎和M2抗炎型巨噬细胞)MMPs的表达模式[29]。他们显示，三种巨噬细胞类型均表达多种MMPs。但是，M1型显示高表达MMP-1,MMP-3和MMP-10,M2型显示高表达MMP-12。他们也对比了不同亚型中MMPs的酶活性，发现M2巨噬细胞分泌的MMPs酶活性最高。另一项研究中，DUFFIELD等揭示，在四氯化碳诱导的可逆性肝损伤模型中，选择性敲除CD11b+巨噬细胞，能破坏基质降解功能，阻碍正常肝组织结构的恢复[30]。这些结果都表明，伤口巨噬细胞亚型构成影响细胞外基质重塑的结果。最近研究中，PARASA等利用新开发的含有人类单核细胞和已分化巨噬细胞的实验性人肺组织模型研究抑制MMPs如何影响结核肉芽肿的形成，其与伤口愈合增殖期肉芽组织的形成类似[31]。为了抑制MMP活性，他们采用广谱抑制剂，200nmol·L-1的马马司他(marimastat)。结果显示，巨噬细胞源的MMP活性有助于肉芽组织的形成。在心肌梗塞引起的小鼠心脏伤口愈合模型中，研究MMP-9的作用。结果显示，巨噬细胞源的MMP-9加快组织胶原蛋白的累积和重塑，促进心脏伤口的愈合[32]。这些研究提示，靶向干预巨噬细胞的MMPs能改善伤口愈合的结果。

7、当下伤口愈合研究方法的局限性及未来发展方向

多种动物模型，包括啮齿类和猪，都应用于伤口愈合过程研究。不幸的是，由于解剖学、生理学、细胞学、免疫学和分子的种间差异，这些模型所得到的研究结果很难适用到人类伤口愈合中。例如，啮齿类动物皮肤有浓密的毛发，可以加快愈合。原因是来自毛囊的干细胞参与了伤口再上皮化过程[33]。尽管猪的皮肤是无毛的，解剖结构更类似于人类皮肤，但是它没有外分泌汗腺，也能参与人类伤口修复[34]。此外，很多在动物模型上开发的伤口愈合疗法也无法应用到人类。因此，迫切的需要在人体直接研究伤口愈合机制。截止到目前，除了非常有限的临床试验，这几乎是不可能的。幸运的是，随着新颖的、高灵敏的分子技术和大规模分析平台的发展，例如转录组测序(RNA-seq),微阵列和定量逆转录PCR(qRT-PCR),能够通过很少的患者活体皮肤组织研究人体伤口愈合过程不同时期的分子学事件[35]。对于新的治疗方法，一个新兴的策略就是利用TGF-β,改变局部伤口愈合平衡，促使瘢痕向再生相转化。TGF-β在成年哺乳动物中，能诱导胚胎样愈合过程。局部给予被称为Juvista的重组TGF-β3多肽治疗人体伤口，其Ⅱ期药效试验显示能显著改善大部分病人的愈合过程，减少疤痕[36]。另一种非药物治疗方法就是局部通过仪器设备，产生静态或者动态的磁场来加速愈合。多个临床研究显示，核磁共振疗法可显著加快伤口愈合[37]。此外，核磁渐变磁场能诱导巨噬细胞的改变，磁场治疗可在无需药物治疗或基因操作的情况下表现出促进伤口愈合的潜力，这是一个巨大的创新。另一个加快伤口愈合的方法是通过加速愈合过程的增殖期。其可通过活化细胞周期调节酶(e.g.ERK1/2MAPkinases)或使用间充质干细胞来实现[38,39]。

下面，我们介绍几种新兴的治疗方法，其能上调巨噬细胞的促伤口愈合活性。这些方法要么依赖改变组织环境，利用抗凋亡因子，生长因子或者辅助细胞(成纤维细胞或者间充质干细胞)来刺激伤口巨噬细胞的促愈合M2表型，要么依赖伤口促炎性M1巨噬细胞的敲除，沉默或者表型转化。例如，抑制/沉默促炎性M1巨噬细胞，改善糖尿病小鼠伤口愈合可通过同时给予抗F4/80和抗TNF-α中和抗体来实现[6]。另一项研究表明，通过阻断干扰素调节因子8(IRF8)抑制细胞凋亡可阻断巨噬细胞极化为促炎性M1表型，改善糖尿病小鼠切除皮肤伤口愈合[40]。注射间充质干细胞或者间充质干细胞条件培养液[41],可增加伤口巨噬细胞和血管内皮祖细胞的数量，改善小鼠和人体伤口愈合。注射体外培养的促愈合M2型巨噬细胞或注射源自健康年轻人体血液的巨噬细胞到伤口部位，可以加速小鼠或人体伤口愈合[42]。FERRER等显示人真皮成纤维细胞促进巨噬细胞极化为促愈合M2表型，加快小鼠伤口的修复[43]。另外可通过添加生物材料，改善巨噬细胞浸润，促进M2表型生成，例如植入水凝胶或者微量递送细胞外基质成分到伤口[44]。

表1M1和M2型巨噬细胞的区别

8、结语

综上所述，巨噬细胞是伤口愈合过程的重要参与者，对炎症期、增殖期和重塑期都具有重要的调控作用。巨噬细胞是一类高度异质性的细胞群，在不同时期和不同病理环境下发挥着不同的作用，充分理解它们的角色和所涉及的作用机制，有利于未来寻找开发全新的伤口愈合治疗方法和药物。

杨燕玲,孙湘婷,黄浩,陈垒.巨噬细胞调控伤口愈合研究进展[J].沈阳药科大学学报,2021,38(03):321-327.