肾结石是泌尿外科常见病之一，近来发病率逐年升高，目前临床上治疗肾结石以手术为主[1]，但经皮肾镜碎石术类的手术不可避免地对肾脏造成损伤，同时，肾结石5年内的复发率高达50%。所以我们迫切地需要一种无创且有效治疗肾结石的方法。按照成分分类，肾结石可以分为草酸钙结石、尿酸盐结石、磷酸盐结石、胱氨酸结石，其中草酸钙结石约占肾结石的80%[2,3]。草酸为影响草酸钙结石形成的重要因素，其对结石形成的影响高于钙[4,5,6]。正常人体内的草酸来源于饮食或肝脏合成[7]，并通过两种方式排出体外：与肠道中的钙形成草酸钙随粪便排出；经肠道吸收入血，经肾脏代谢，以尿液的形式排出。人体缺乏降解草酸的酶，而肠道菌群中有一些具有草酸降解功能的菌群[8,9]，以其是否将草酸作为唯一碳源分为专性草酸降解菌如产甲酸草酸杆菌，以及条件性草酸降解菌如乳酸杆菌、双歧杆菌等。研究[10,11,12,13,14]发现，肾结石患者与健康人相比，肠道中草酸降解菌及草酸降解相关的基因明显减少。草酸降解菌因参与了草酸的代谢从而对草酸钙结石具有治疗作用。

不少研究尝试将草酸降解菌作为益生菌制剂来治疗肾结石，该益生菌制剂由产甲酸草酸杆菌一种或几种条件性草酸降解菌构成[15,16,17]。然而，上述益生菌对尿草酸的降低效果不显著[18,19]。肠道菌群对草酸的降解不局限于草酸降解菌，肠道中可能存在一个具有草酸降解功能的微生物网络。适应草酸降解的整体微生物群落比单个菌能更好地转移草酸降解能力[20,21]。豚鼠的肠道菌群已被证实具有草酸降解能力，而SD大鼠的草酸降解水平随着持续接触草酸而下降，表明它的肠道微生物群对草酸的不适应性[22]。因此，本研究创新性地选择豚鼠及大鼠作为动物模型以探索肠道菌群移植（FMT）对草酸降解的影响，为肠道微生物移植治疗草酸钙结石提供实验室依据。

1、材料与方法

1.1 实验对象及分组处理

实验分为两个阶段，第一阶段检测肠道菌群移植的有效性，第二阶段探索肠道菌群移植对草酸代谢的影响和肾脏保护作用。第一阶段使用8周龄雄性豚鼠6只，体质量300～350 g，为肠道菌群移植的供体。5周龄雄性SD大鼠12只，体质量140～160 g，采用随机数字法分为两组，正常饮食对照组（SC）及正常饮食+肠道菌群移植组（SC+FMT），每组6只。6只豚鼠给予豚鼠饲料喂养，SC组及SC+FMT组大鼠给予正常大鼠饲料喂养，第14天开始，用代谢笼收集6 h内的新鲜豚鼠粪便，以生理盐水稀释后过滤，将滤液给SC+FMT组大鼠灌胃，每只大鼠2 mL/次，连续灌胃7 d。使用代谢笼收集两组大鼠的粪便及24 h尿液。第二阶段使用8周龄雄性豚鼠6只，5周龄雄性SD大鼠18只，体质量140～160 g，采用随机数字法分为3组，正常饮食对照组（SC）、高草酸饮食+PBS灌胃组（OD+PBS）、高草酸饮食+肠道菌群移植组（OD+FMT),OD+PBS组及OD+FMT组大鼠给予5%草酸含量饲料喂养。第14天开始，使用PBS溶液对OD+PBS组大鼠进行灌胃，使用稀释的豚鼠粪便滤液给OD+FMT组大鼠灌胃，每只大鼠2 m L/次，连续灌胃7 d。使用代谢笼收集3组大鼠的粪便及24 h尿液。实验经武汉大学动物实验中心伦理委员会批准（WP20220232）。

1.2 肠道菌群测序

采用DP712试剂盒提取粪便DNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用Nano Drop测定DNA浓度和纯度。对16S r RNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，引物为341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™Fluorometer (Promega,USA）对回收产物进行检测定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific,USA）进行建库。利用Illumina公司的Miseq PE300/Nova Seq PE250平台进行测序。使用fastp软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接；使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释。使用QIIME2软件进行Venn图、物种组成、PCA主成分分析及LEf Se分析。

1.3 血清及尿液生化指标检测

第28天使用代谢笼收集SD大鼠尿液，采用高效液相色谱法（HPLC）测量尿液中草酸浓度，使用对应试剂盒检测尿素、尿酸及尿肌酐。第29天取大鼠下腔静脉血，使用对应试剂盒检测血尿酸、血尿素及血肌酐。处死大鼠，取肾脏组织，采用4%多聚甲醛固定，进行常规的切片。

1.4 肾脏免疫组化

将3μm的肾脏组织切片在二甲苯和分级乙醇溶液中脱蜡和水化，在枸橼酸缓冲液中使用微波加热进行修复，然后将组织切片用3%的H2O2孵化，以灭活内源性过氧化物酶。用抗ACE(SA1022,BOSTER，稀释度1∶800）、抗OPN(YT3467,Immunoway，稀释度1∶300）和抗肾素（YT4047,Immunoway，稀释度1∶100）分别处理切片，随后使用二抗（RS0002,Immunoway，稀释度1∶200）处理切片。最后，进行DAB染色和苏木精复染以观察抗原结合情况，在显微镜下观察，采集图像。

1.5 RT-PCR检测肾脏损伤因子

取50～100 mg肾组织，以TRIZOL法提取组织RNA，经逆转录成c DNA，以GAPDH作为内参照，采用20μL体系至PCR仪进行PCR扩增，按试剂说明书设置反应温度与时间。最后用2-ΔΔCT计算各目的基因的表达变化。所用引物序列见表1。

1.6 统计学方法

应用SPSS 26.0软件对所得数据进行统计学分析，数据结果以均数±标准差表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 肠道菌群移植影响了大鼠的肠道菌群

如Venn图所示，除两组大鼠与豚鼠共享的1 936个OTUs,SC+FMT组大鼠比SC组大鼠与豚鼠共享更多的OTUs（图1A）。而PCo A分析发现，SC+FMT组大鼠在接受了肠道菌群移植后，其肠道菌群偏离了SC组大鼠的肠道菌群并与豚鼠的肠道菌群类似，FMT导致了SC+FMT组大鼠的肠道菌群是豚鼠和SC组大鼠肠道菌群的混合物（图1C）。此外，FMT引起了SC+FMT组大鼠肠道菌群的变化，SC+FMT组与SC组大鼠的肠道菌群在门水平及属水平上有所差异（图1B、D）。总的来说，肠道菌群移植在正常饮食的大鼠中发挥了作用并影响了大鼠的肠道菌群。

表1 引物序列  

图1 SC组、SC+FMT组大鼠及豚鼠（GP）的肠道菌群  

2.2 肠道菌群移植促进大鼠肠道中微生物网络的建立

为探究肠道菌群移植对草酸饮食大鼠肠道菌群的影响，我们对OD+PBS组及OD+FMT组大鼠的肠道菌群进行了LEf Se分析，结果发现，有21个属的细菌例如Muribaculaceae科的菌属、Lactobacillus属、Bifidobacterium属等在OD+FMT组中显著富集（图2），而这3个属的细菌（Muribaculaceae科的菌属、Lactobacillus属、Bifidobacterium属）是草酸降解菌。表明在高草酸饮食的大鼠中，肠道菌群移植有助于在肠道中建立包含Muribaculaceae等草酸降解菌的微生物网络。

图2 OD+PBS组与OD+FMT组大鼠肠道菌群的LEfSe分析

2.3 肠道菌群移植降尿草酸及肾脏保护作用

我们进一步比较了三组大鼠的尿草酸排泄量以探讨肠道菌群移植对草酸代谢的影响。与SC组相比，OD+PBS组大鼠的尿草酸显著增加，而OD+FMT组与OD+PBS组相比，尿草酸显著减少。结果表明，肠道菌群移植有效减少了高草酸饮食引起的尿中草酸的高排泄，这种减少可能与肠道菌群对草酸的降解增强有关。类似的，与OD+PBS组相比，OD+FMT组的尿素、尿酸以及尿肌酐显著减少（P<0.05，表2）。此外，我们发现OD+PBS组的血清尿素氮/肌酐水平显著高于SC组。另一方面，与OD+PBS组相比，OD+FMT组的血清尿素氮/肌酐水平明显下降（P<0.05，表2）。为了进一步研究肾脏在分子水平的变化，我们检查了几种肾保护相关的标志物的水平，包括肾素、ACE和OPN。与SC组大鼠相比，OD+PBS组的肾素m RNA表达明显增加，表明大鼠的肾脏受到了草酸饮食引起的负荷。然而，与OD+PBS组相比，肠道菌群移植处理的大鼠的肾素m RNA水平明显下降。肾素m RNA表达的减少表明草酸负荷的减弱，这可能与肠道菌群移植所介导的草酸降解的增强有关。与SC组相比，OD+PBS组和OD+FMT组中ACE和OPN的m RNA水平都被下调。用肠道菌群移植治疗后，与OD+PBS组相比，OD+FMT组下调的OPN m RNA表达得到了极大的恢复（图3）。OPN的m RNA表达量增加，说明防止草酸钙结石结晶形成的能力在一定程度上得到了恢复。为进一步验证肠道菌群移植对大鼠肾脏草酸钙结晶诱导的损害的改善作用，我们进行了免疫组化染色，以评估肾素、ACE和OPN的蛋白水平。与m RNA表达一致，免疫组化染色强度表现出类似的结果。肠道菌群移植后，增加的肾素明显减少，而减少的OPN则显著增加（图4），表明肠道菌群移植对大鼠有肾脏保护作用。

3、讨论

高草酸尿是影响草酸钙结石形成的重要因素，同时，草酸因其毒性可对肾脏造成损伤。但草酸可被肠道菌群如产甲酸草酸杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌代谢。产甲酸草酸杆菌通过一个简单的两步酶促反应将草酸降解为CO2和甲酸，该反应涉及草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶。尽管由产甲酸草酸杆菌或其他草酸降解菌组合形成的益生菌可以减少尿草酸排泄，它们不总是起效。更重要的是，益生菌中的细菌在肠道的定值较短暂，事实上，结肠中存在数以十亿计的肠道菌群。肠道内的微生物群落存在于功能整合的共生网络中，而不是作为孤立的功能物种[23]。因此，肠道菌群对草酸的代谢可能不局限于草酸降解菌。少数研究已经初步探索肠道菌群对于草酸代谢的作用。

我们将豚鼠的肠道菌群整体转移给SD大鼠。移植提高了SD大鼠肠道菌群的微生物多样性以及与豚鼠肠道菌群的相似性。肠道菌群整体移植激活了大鼠肠道中涉及Muribaculaceae等草酸降解菌的草酸代谢微生物网络。接着，我们探索了草酸饮食大鼠（OD+PBS组及OD+FMT组）的草酸代谢情况，肠道菌群移植导致了大鼠尿草酸排泄的减少。进一步的，我们从两个方面展现了肠道菌群移植的肾脏保护作用。一方面，相较于OD+PBS组，OD+FMT组大鼠的尿素、尿酸、肌酐、血尿素氮/肌酐以及血尿酸的减少说明草酸引起的肾脏损伤在一定程度上恢复，这是由于微生物网络中的草酸降解菌对草酸的降解导致草酸对肾脏的毒性作用被抑制。另一方面，与OD+PBS组相比，OD+FMT组肾素m RNA的下调和OPN m RNA的上调表明该组大鼠的肾脏能更好的免受草酸毒性和肾结石引起的损伤。总的来说，在大鼠的肠道中，有一个涉及Muribaculaceae等草酸降解菌的微生物网络被肠道菌群移植激活。作为结果，尿草酸排泄减少，草酸引起的肾脏损伤一定程度上恢复。

表2 三组大鼠的血清及尿液生化指标 

图3 PCR检测肾脏组织中肾素、ACE及OPN m RNA的表达

图4 免疫组化学染色检测各组大鼠肾脏组织中肾素、ACE及OPN的蛋白表达

草酸降解微生物通常存在于兔子、豚鼠、马和猪的大肠中，这些草酸降解微生物的相对丰度随着草酸供应的增加而增加。豚鼠作为常见的实验室动物且豚鼠与SD大鼠同属于啮齿目动物，这使得两个物种的肠道菌群更具有移植性。肠道微生物移植越来越多地被用于治疗不同疾病如艰难梭菌感染、代谢性综合征、功能性胃肠病和炎症性肠病。特别是对于艰难梭菌感染的治疗颇有成效[24]。肠道中可能存在一个具有草酸降解功能的微生物网络，所以我们选择豚鼠及SD大鼠作为肠道菌群移植的供受体进行实验。与研究[20,25]结果类似，我们发现肠道菌群移植明显降低了高草酸饮食大鼠的尿草酸排泄。除此之外，我们还发现接受肠道微生物移植的大鼠肾脏中草酸钙结晶沉积减少，草酸诱导的肾脏损伤在一定程度上得到恢复。MILLER等[21,26]在白喉林鼠和健康人的肠道内发现了草酸代谢相关的微生物网络，我们在豚鼠的肠道中发现了类似的以Muribaculaceae科的细菌为代表的微生物网络。Muribaculaceae科曾被命名为S24-7科，近些年被系统地研究，Muribaculaceae科的细菌被证实具有草酸降解能力。既往研究探索了肠道菌群移植对草酸代谢的影响。而我们的研究进一步研究了肠道菌群移植对肾脏的保护作用，这将为临床上治疗肾结石提供新的思路。

本研究也存在局限性，对于肠道菌群移植对高草酸饮食诱导的大鼠肾脏损伤的保护作用，我们只是检测了肾功能相关指标，并没有研究保护作用的具体机制，我们设想肾脏保护作用可能与肠道菌群的代谢物有关，也就是“肠-肾轴”理论，我们将在下一步实验中检测肠道及血中肠道菌群的代谢物。

综上所述，肠道菌群移植能够将豚鼠肠道中与草酸代谢相关的微生物群落转移至大鼠肠道内，激活了大鼠肠道中以Muribaculaceae等草酸降解菌为代表的微生物网络。草酸介导的肾脏损伤因微生物网络对草酸的降解而恢复，因此，肠道菌群移植对大鼠肾脏具有保护作用。然而，肠道菌群可能以其他方式参与草酸代谢[27]，这需要我们进行进一步的研究。

参考文献:

[1]吴志良.不同手术方式治疗男性复杂性肾结石的疗效和对患者性功能影响的比较[J].实用医学杂志,2018,34(20):3449-3453.

[27]张建清,王庆,江克华,等. microRNA在肾结石疾病中的作用机制和研究进展[J].实用医学杂志,2023,39(6):773-777.

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:81502210); 中部战区总医院育英计划面上项目(编号:ZZY202211,ZZYCZ202101);

文章来源:王演,潘铁军,刘振宇,等.肠道微生物网络在高草酸诱导大鼠肾损伤中的保护作用[J].实用医学杂志,2024,40(13):1771-1777.