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利用RAPD和ISSR标记进行湖南省饭豆地方种质资源遗传多样性研究

2020-05-12 568 上传者：管理员

摘要：为揭示湖南省饭豆地方品种的遗传多样性，促进种质资源的有效保护和利用。本研究利用RAPD和ISSR标记分析了源于湖南省各地36份古老饭豆地方品种的遗传多样性，并采用UPGMA方法进行了遗传聚类分析。结果表明：12个RAPD引物和4个ISSR引物在供试材料中共扩增产生81条带型清晰的条带，平均每个引物扩增产生5.06个条带；其中59个为多态性条带，占总扩增条带的72.84%，具有多态性引物的PIC值在0.397～0.968之间；通过UPGMA法进行聚类分析表明供试材料的遗传相似系数在0.605～0.877之间，供试材料被分为4大类，且聚类结果表现明显的地域特征。本研究结果可为本省饭豆种质资源保护和育种研究提供理论依据。

关键词：
保护
农业资源
利用
湖南省
种质资源
遗传多样性
饭豆
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饭豆是豆科蝶形花亚科豇豆属的一个栽培种[1]，是湖南省传统的夏播食用豆类作物之一。由于其生长周期短、抗旱性强，且丰富的蛋白质和微量元素，近年来已成为农作物种植结构调整的重要搭配作物。但随着土地流转政策的颁布和实施，农业生产正向着规模化、集约化迅速发展，传统分散种植、粗放管理的饭豆农家品种受到巨大冲击，并开始迅速消失。另一方面，湖南省饭豆相关研究长期以来一直非常滞后，目前生产上应用的基本为农家品种，种质资源利用率非常低下。因此，如何对现有种质资源的合理保护和创新利用是目前本省饭豆产业研究的重要内容和主要任务。

同其他作物一样，种质资源评价与分析是饭豆优异资源挖掘和利用的基础。分子标记技术的出现为种质资源遗传多样性分析提供了新的技术平台，分子标记具有鉴定周期短、多态性高、客观性强，且可以覆盖整个基因组，目前已成为农作物种质资源遗传多样性分析的重要工具[2,3,4,5,6,7]。但由于饭豆基因组研究相对落后，目前公开发表的豇豆属SSR标记数量极其有限，且多态性较低，限制了其应用效率[8,9,10]。RAPD和ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)标记可以在不同物种间通用，且可获得几倍于SSR的信息量，在植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性研究被广泛应用[11,12,13,14,15,16]。本研究利用RAPD和ISSR标记对“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”中收集到的36份湖南省古老饭豆地方品种进行遗传多样性分析，以期从分子水平揭示湖南省古老饭豆地方种质资源的遗传多样性，为湖南省饭豆资源有效保护和良种选育选择提供理论依据。

1、材料与方法

1.1供试材料

供试材料为36份湖南饭豆地方品种，为“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”征集与收集到的地方种质资源，保存于湖南省农作物种质资源库。详见表1。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA提取

2017年7月初取36份供试材料单株的幼嫩叶片约2cm2置于2mL离心管中，-20℃保存。基因组DNA提取参照王同华等[17]的方法进行，并略有改进。将上述供试单株幼嫩叶片置于研钵中，加800μL2%预冷的CTAB溶液研磨匀浆；然后转移至2.0mL离心管，65℃水浴45min后加800μL24:1溶液（体积比氯仿：异戊醇=24:1），不间断翻转摇晃5min以上；4℃条件下12000r/min冷冻离心15min，吸取400μL上清至新的2.0mL离心管，并加入600μL预先预冷的无水乙醇，于-20℃冷冻30min;4℃条件下12000r/min离心6min，弃上清，于室温下晾干；最后加300μLddH2O溶解，于4℃保存。利用经紫外分光光度计测定其在260nm和280nm的吸光值，并利用水平胶检测其质量和浓度。

表136份供试饭豆材料的名称及来源

1.2.2RAPD和ISSR分析

12个RAPD随机引物序列和4个ISSR引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物名称和序列见表2。PCR反应体系总体积为20μL:3μL模板DNA,2μL10×Buffer（含Mg2+),2μL100μmol/L引物，0.4μL10mmol/LdNTP,0.4μL2.5U/μLTaqDNA聚合酶，加ddH2O至20μL，用20μL矿物油覆盖。PCR反应循环参数：94℃预变性5min,94℃变性45s,58℃退火30s,72℃延伸45s，此后每循环退火温度降低0.5℃，共计10个循环；94℃变性45s,53℃退火30s,72℃延伸45s，共40个循环；72℃延伸10min,4℃保存；PCR扩增产物利用质量比3%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并在凝胶成像系统中进行读带与拍照。

1.2.3数据统计分析

按照每个供试材料在相同电泳迁移位置上PCR扩增产物谱带的有无进行统计，其中有带记为1，无带记为0，形成0,1原始矩阵。按照Nei提出的公式（见公式(1)）计算各引物的多态性信息含量(PIC)。

其中fi为i位点的基因频率[18]。采用生物学软件NTSYS-pc2.10e进行供试材料的遗传多样性分析，先利用SimQual程序计算各供试材料间的遗传相似系数(GS)，并获得遗传相似系数矩阵；再用SHAN程序中的UPHMA进行聚类分析，并通过Treeplot模块绘制供试材料的聚类树状图。

表2本研究所用RAPD和ISSR引物序

2、结果与分析

2.1供试材料基因组DNA提取

提取的供试材料基因组DNA经紫外分光光度计测定其在260nm和280nm的吸光值(A260/A280)，结果基因组DNA样品A260/A280比值均在1.82～1.98之间，由于提取过程未加核糖核酸酶，部分样品的吸光比值稍微偏高。将提取基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，基因组DNA电泳主带清晰，基本无拖尾现象（图1）。以上结果均说明本研究提取的样品基因组DNA质量可以满足RAPD-PCR和ISSR-PCR检测的需要。

图1供试材料基因组DNA琼脂糖电泳检测

2.2RAPD和ISSR标记在供试材料间的多态性

12个RAPD引物和4个ISSR引物在供试材料中共扩增产生81条带型清晰的条带，平均每个引物扩增产生5.06个条带，扩增产物片段大小在150～1100bp（图2为部分供试材料的PCR扩增结果）；其中59个为多态性条带，占总扩增条带的72.84%，具有多态性引物的PIC值在0.397～0.968之间，其中以ISSR引物810的最高为0.968,RAPD引物R14的最低仅为0.12。研究结果表明本研究选用的RAPD和ISSR引物具有较好的多态性，也表明供试材料间存在较高的遗传差异。

2.3供试材料间的遗传聚类和相似度分析

利用生物学软件NTSYS-pc2.10e对36份供试饭豆农家品种进行聚类分析，结果表明本研究获得的分子标记数据可将供试的36份材料完全区分开，各材料间的遗传相似系数在0.6049～0.8765之间，遗传多样性相对较为丰富。通过UPGMA法进行聚类分析，可将36份供试材料分为四大类，见图3。聚类结果表明不同资源间亲缘关系的远近与地理来源存在一定程度的吻合，其中第一类的8个地方资源中6个位于湘南，包含1份大粒型（百粒重超过10g）品种；第二类的16个地方资源中10个来源于湘西和怀化，该类群包含了供试材料种皮为黄色的全部品种和4份大粒型品种；第三类的11个地方品种来源于湘西和湘南地区各5个，包含1份大粒型品种；其中，浏阳锁匙豆被单独聚为一大类，其种皮颜色呈黄绿色，百粒重达12.2g，有待对其遗传背景进一步分析。

图2引物OPC02对部分份供试材料的PCR扩增

图336份供试材料的分子标记聚类树状图

3、讨论与结论

由于RAPD和ISSR标记遗传信息量大、多态性高，且不需要依赖靶基因组的序列信息，是基因组研究相对落后的物种分子生物学研究的首选标记类型，已在品种鉴定和遗传多样性分析得到广泛应用[4,13,14,15,16,17,20,21]。豇豆属作物的基因组信息研究水平较为落后，目前其种质资源研究主要以表型性状鉴定为主。近年来，学者开始利用分子标记技术用于豇豆、绿豆、小豆等作物的遗传多样性研究，结果表明利用分子标记可对不同种质进行有效鉴定，获得的聚类组群结果与地理来源密切相关[3,6,8,10,11]，但尚未有利用分子标记技术分析饭豆种质资源多样性研究的公开报道。本研究首次尝试利用十字花科和兰科等作物公开发表的RAPD和ISSR标记，对湖南省36份保存至今的古老饭豆品种（当地保留15年以上的农家品种资源）进行遗传多样性分析的可行性，可为湖南省饭豆种质资源的保护和利用提供科学依据。

为确保研究结果的可靠性，本研究将30个RAPD引物和12个ISSR引物中的16个扩增稳定性好、多态性高的引物PCR扩增结果进行统计，结果表明基于分子标记的遗传聚类结果与供试材料的地理来源存在相关，而通常的研究也表明地理来源是物种亲缘关系分析的重要指标[3,5,8,13,14,15]，这说明本研究利用RAPD和ISSR标记获得遗传分析数据具有可靠性和客观性。从本研究的聚类结果显示供试材料中超过百粒重10g的大粒型品种资源中有4个分布在湘西自治州和怀化地区，说明该资源的遗传背景具有特殊性，需要在今后的种质资源保存与利用中加以重视。另外，大粒型品种浏阳锁匙豆被单独聚为一类，该结果有待于从其来源和遗传背景上进一步研究。

由于RAPD和ISSR标记在基因组上具有完全随机性，这些标记难以在不同遗传图谱上进行位置锚定，因此不能在不同遗传图谱和连锁群间进行比较，从而限制了其不同实验室之间的数据交流。因此，笔者认为今后通过全基因组序列信息挖掘，开发高密度的、多态性高的饭豆基因组功能标记，是实现饭豆种质资源的准确高效分子鉴定与数据共享的技术基础。

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