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水痘-带状疱疹病毒抗血清的制备及检定

2024-08-20 32 上传者：管理员

摘要：目的制备水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）收获物，纯化后免疫日本大耳白兔，制备VZV抗血清，并进行各项检定。方法将VZV Oka株（vOka）在人二倍体细胞2BS株中传代培养，病毒收获后经超速离心纯化，制备免疫原，与弗式佐剂混合后经背部多点注射免疫雌性日本大耳白兔5只，制备VZV抗血清。Western blot检测血清抗体的特异性；测定膜抗原荧光抗体（fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA）效价和血清抗体中和效价，并对两种检测方法的结果进行相关性分析。利用抗体效价较高的血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒进行异种病毒干扰试验。结果制备的VZV抗血清可特异性结合vOka和Oka-7S病毒收获物及gE和ORF7蛋白等多种VZV抗原；3免血清FAMA抗体效价可达1∶16 384，血清抗体中和效价达1∶256；根据Karl Pearson相关系数分析得出两种检测方法结果呈线性相关。异种病毒干扰试验中试验组与对照组病毒滴度差值均<0.50 lgCCID50/mL，表明VZV抗血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒滴度均无干扰。结论成功制备了特异性强，亲和力高的VZV抗血清，为VZV成分疫苗的检定奠定了基础。

关键词：
中和抗体
兔抗血清
嗜神经性病毒
带状疱疹皮肤损伤
水痘-带状疱疹病毒
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水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）是一种高度传染性、嗜神经性病毒。人类是VZV唯一的自然宿主[1]。VZV主要通过吸入含有病毒颗粒的唾液飞沫或直接接触来自水痘或带状疱疹皮肤损伤的污染物进行传播[2]。VZV原发感染引起水痘，病毒沿整个神经轴传播，并潜伏在背根神经节和脑神经节中，随着年龄的增长或免疫缺陷患者对VZV的免疫下降，病毒从潜伏状态再激活，导致带状疱疹（herpes zoster,HZ)[3-5]。VZV属于疱疹病毒科（Herpesviridae），具有1个长度约125 000 bp的线性双链DNA基因组，由末端长重复序列（terminal repeat long,TRL）、内部长重复序列（internal repeat long,IRL）为界的独特长区域（unique long,UL）和以内部短重复序列（internal repeat short,IRS）、末端短重复序列（terminal repeat short,TRS）为界的独特短区域（unique short,US）组成，基因组共编码71个开放阅读框（open reading frame,ORF)[6-8]。

接种疫苗是预防水痘和HZ的重要手段，在日常VZV疫苗检定中，如病毒鉴别试验，外源因子检测等，常需使用大量高效价血清抗体，但目前国内尚无商品化的VZV抗血清供应，而国外的VZV抗血清采购过程中存在药物管理严格，采购流程复杂等问题。此外，近几年WHO等国际组织倡导开发联合疫苗，麻腮风水痘（measles,mumps,rubella and varicella,MMRV）联合疫苗的研发成为热点[9]。而MMRV联合疫苗中各组分疫苗的效力检测是疫苗质量控制中的难点。联合活疫苗病毒滴度测定的传统方法为完全中和法，即将待测病毒外的其他所有病毒完全中和后检测。对于MMRV联合疫苗，水痘疫苗组分的效力检测一直是新型四联疫苗研发的障碍[10]。本研究旨在制备VZV抗血清，并进行检定，以期为VZV成分疫苗的检定奠定基础。

1、材料与方法

1.1病毒、细胞及疫苗

VZV v Oka株、麻疹病毒、风疹病毒（均-70℃保存）、人二倍体细胞2BS株、Vero和RK-13细胞均由本公司提供，v Oka和Oka-7S病毒收获物由本公司制备[11-12];Oka-7S病毒是在v Oka毒株基础上基因改造沉默ORF7表达制备，由中国科学院武汉病毒研究所提供[13-14]；腮腺炎疫苗由科兴（大连）疫苗技术有限公司提供。

1.2主要试剂及仪器

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自润生大业生物材料有限公司；MEM培养液和PBS缓冲液购自美国Gibco公司；胰蛋白酶和谷氨酰胺购自美国Sigma公司；HRP标记的山羊抗兔Ig G购自北京中杉金桥生物技术有限公司；FITC标记的山羊抗兔Ig G购自武汉三鹰生物技术有限公司；VZV ORF7蛋白、g E蛋白和v Oka阳性血清均由本公司制备[11-12]；细胞工厂和细胞培养瓶购自美国康宁公司；超速离心管购自美国Millipore公司。

1.3实验动物

普通级日本大耳白兔，雌性，2～4月龄，体质量2～3 kg，购自长春生物制品研究所有限责任公司，动物生产许可证号：SYXK（吉）2020-0015，动物使用许可证号：SYXK（吉）2022-0002。本实验均以科研为目的对日本大耳白兔进行养殖和使用，且按照长春生物制品研究所有限责任公司动物伦理相关规定进行。

1.4 VZV免疫原的制备

将2BS细胞接种至40层细胞工厂，37℃培养；待细胞长成单层后，按MOI=0.01接种VZV,37℃吸附40 min；弃病毒液，加入含2%牛血清的MEM细胞维持液，37℃培养3～4 d；待细胞病变达70%，收获病毒，弃细胞培养液，用无血清MEM培养液洗涤细胞2～3次，加入0.02%EDTA消化细胞5 min,4℃，300×g离心10 min，收获细胞沉淀，用PBS重悬，病毒收获物反复冻融2次，4℃，300×g离心10 min，收获上清进行病毒超速离心，120 000×g离心2 h；病毒沉淀用20 m L PBS重悬，双抗体夹心ELISA法测定g E蛋白浓度[12],Bradford法测定蛋白总浓度。

1.5动物分组及免疫

取日本大耳白兔，分为v Oka组（5只）和PBS组（1只），将制备的免疫原与弗氏佐剂按体积分数1∶1混合，经背部多点注射2 m L弗氏完全佐剂乳化的抗原，免疫剂量为300μg/kg(ELISA法测定g E蛋白浓度），后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂。各组动物均进行3次免疫，每次间隔14 d，免疫后7 d经耳缘静脉采血，末次免疫后14 d，经心脏采血，4℃，1 000×g离心5 min，分离血清，200μL/管分装，-70℃保存。

1.6多克隆抗体特异性检测

采用Western blot法。将v Oka和Oka-7S病毒收获物及VZV ORF7和g E蛋白样品加入蛋白上样缓冲液，沸水浴15 min，经12%SDS-PAGE分离目的蛋白后，转移至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭30 min;PBST洗膜3次，每次10 min，加入制备的VZV家兔免疫血清（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；PBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的山羊抗兔Ig G(1∶5 000稀释），室温孵育1 h;PBST洗膜3次，每次10 min，采用ECL显色系统暗室曝光显影，观察结果。

1.7血清膜抗原荧光抗体（fluorescent antibody to mem-brane antigen,FAMA）效价检测

1.7.1抗原片制备

v Oka株病毒按MOI=0.02感染2BS细胞（T75，细胞数约2×107个），病毒吸附60 min后，补加病毒维持液，病毒感染3 d后，收获感染细胞，调节细胞浓度至1.5×105个/m L，制备细胞悬液。将细胞悬液滴入12孔载玻片中，20μL/孔，将载玻片置于湿盒中，37℃，5%CO2培养箱中孵育30 min，冷丙酮室温固定15 min，晾干。

1.7.2样品制备

将血清样品56℃灭活30 min，用PBS连续2倍系列稀释，同时设PBS组和阳性血清对照组，加入96孔板，每孔20μL,37℃孵育30 min;PBS浸泡清洗3次，每次5 min，晾干。将荧光抗体1∶1 000稀释（抗体中加入0.01%伊文斯蓝染液），加入20μL至抗原载玻片，37℃孵育30 min;PBS浸泡清洗3次，每次5 min，晾干。滴加甘油缓冲液覆盖抗原片。

1.7.3镜检

将载物片置荧光显微镜下观察，若呈现黄绿色膜性荧光，判为阳性；若呈现非膜性浅绿色，判为阴性。统计数据[15]。

1.8血清中和抗体效价检测

采用蚀斑减少法。将免疫前及免疫后每隔7 d收集的血清56℃水浴灭活30 min，倍比稀释（1∶4～1∶256），将稀释至500～1 000 PFU/m L的VZV病毒液与稀释后的免疫血清等体积混合，置37℃水浴中和60 min；接种6孔板中长满单层的2BS细胞，100μL/孔，37℃，5%CO2条件下培养7～10 d；考马斯亮蓝染色计数蚀斑数，以中和后蚀斑数减少50%的血清最高稀释度为中和抗体滴度[16]。

1.9血清FAMA效价与中和抗体效价检测相关性的比较

收集3次免疫兔血清的FAMA效价和中和抗体效价检测结果，根据Karl Pearson相关系数分析二者的相关性。

1.1 0血清对异种病毒干扰试验

设试验组、病毒对照组和血清对照组：试验组将麻疹、腮腺炎或风疹病毒与等体积VZV抗血清（1∶128稀释）混合；病毒对照组将麻疹、腮腺炎或风疹病毒与等量PBS混合；血清对照组将VZV抗血清（1∶128稀释）直接接种细胞。各组均于37℃水浴中和60 min后分别接种至Vero、Vero和RK-13细胞，37℃，5%CO2培养箱培养7 d后，观察其对细胞生长有无干扰及细胞毒性作用。试验组病毒滴度3次检测的下降值<0.50 lg CCID50/m L则判定为抗血清对该病毒滴度无干扰[17]。

1.11统计学分析

采用Graph Pad Prism 7软件进行绘图及统计学分析，实验数据以平均数±标准误差（mean±SEM）表示，组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1病毒收获物的制备与对照组2BS细胞相比，v Oka病毒感染细胞72 h后，细胞病变达70%以上，见图1。

图1 v Oka株病毒感染2BS细胞不同时间的细胞形态（×100)

2.2病毒抗原制备及定量

纯化后的病毒抗原经双抗体夹心ELISA法检测，g E蛋白浓度为737.1μg/m L,Bradford法检测蛋白总浓度为1 655μg/m L。

2.3多克隆抗体的特异性

Western blot检测结果显示，制备的VZV抗血清可特异性结合v Oka和Oka-7S病毒收获物及g E和ORF7蛋白等多种VZV抗原，表明特异性良好，见图2。

图2 Western blot分析VZV抗血清的特异性

Fig.2Western blot analysis of specificity of VZV antiserum

M：蛋白质marker;1:2BS细胞；2:vOka病毒收获物；3:Oka-7S病毒收获物；4:ORF7蛋白；5:gE蛋白。

2.4血清FAMA效价

荧光显微镜下观察显示，v Oka组呈现明显黄绿色膜性荧光，判为阳性，PBS组无明显黄绿色荧光，判为阴性，见图3。随着免疫次数的增加，2免和3免后v Oka组血清FAMA效价显著升高，且差异均有统计学意义（t分别为5.672和6.163,P均<0.001),3免后兔血清FAMA效价达1∶8 192～1∶16 384，见图4。

图3各组血清FAMA镜检图片（×100)

图4不同免疫次数v Oka组血清的FAMA效价

2.5血清中和抗体效价

v Oka组兔血清1∶128稀释仍可完全中和1 000 PFU/m L的VZV,PBS组细胞出现明显蚀斑，表明无中和VZV的活性，见图5。随着免疫次数的增加，2免和3免后v Oka组血清中和效价显著升高，且差异均有统计学意义（t分别为3.825和3.780,P均<0.01),PBS组血清无中和VZV的活性，见图6。

图5各组血清中和抗体效价测定噬斑图（×100)

图6不同免疫次数v Oka组血清中和抗体效价

2.6血清FAMA效价与中和抗体效价的相关性

根据Karl Pearson相关系数分析血清FAMA效价与中和抗体效价检测的相关性，得出R2=0.935 8,P<0.000 1，表明两种方法检测结果呈线性相关，见图7。

图7血清FAMA效价与中和抗体效价检测的相关性分析

2.7血清对异种病毒的干扰

3次检测试验组与病毒对照组相比，麻疹、腮腺炎、风疹病毒滴度的变化均<0.50 lg CCID50/m L，且差异均无统计学意义（t分别为0.935、2.091和1.449,P均>0.05），见表1。表明VZV抗血清对麻疹、腮腺炎、风疹病毒无干扰作用。

表1 VZV抗血清对异种病毒的干扰试验结果

3、讨论

几乎所有人体内均有VZV潜伏，VZV再激活导致的HZ可能引起HZ后神经痛（postherpetic neuralgia,PHN）、脑膜炎或多发性颅神经麻痹等疾病[18-19]。全球范围内每年约有420万人因VZV感染引发的严重并发症住院治疗。此外，HZ的患病风险随着年龄的增长而增加，尤其目前很多国家老龄化严重，美国65岁及以上人口预计将从2003年的3 600万增至2030年的7 200万。HZ及其伴随的严重神经系统并发症给患者带来病痛的同时也给社会造成巨大的医疗负担[20-21]。

接种疫苗可有效预防VZV感染[22]。在疫苗检定中，VZV抗血清在毒种的外源因子、支原体检定以及疫苗鉴别试验和多联疫苗的滴度测定等试验中发挥重要作用，但目前国内尚无商品化的VZV抗血清供应，而国外的VZV抗体价格昂贵，不易购买。因此，制备出高特异性、高效价的VZV抗血清至关重要。本研究将v Oka株在人二倍体细胞2BS株中传代培养，收获病毒后经超速离心纯化，成功制备了VZV抗原。弗氏佐剂由石蜡和羊毛脂按一定比例混合而成，与抗原混合乳化后，形成稳定的油包水乳剂，可增强免疫效果[23]。本研究将VZV抗原与弗式佐剂混合后经背部多点免疫家兔，成功制备了VZV抗血清。Western blot检测显示，血清抗体能与多种VZV抗原特异性结合。

中和试验是衡量机体对水痘及HZ疾病免疫力最重要的指标。中和抗体与病毒结合后，使病毒失去吸附、穿入宿主细胞的能力，从而阻止了病毒在宿主细胞内的复制和病毒感染机体的过程。中和试验主要应用于鉴定病毒、分析病毒抗原的性质、测定免疫血清的抗体效价等。VZV中和抗体测定方法对考核水痘减毒活疫苗、HZ减毒活疫苗、亚单位HZ疫苗的免疫效果具有十分重要的意义[24]。传统的蚀斑减少中和试验虽然灵敏度高，但耗时长，操作复杂。FAMA法检测VZV血清效价具有灵敏度高、特异性好、省时及操作简便等优点，其原理是由于VZV与致病性和免疫原性相关的具有中和抗原表位的糖蛋白主要位于病毒囊膜和感染细胞膜上，以VZV感染细胞为抗原，荧光标记Ig G为二抗，检测血清中VZV特异性抗体，所形成的抗原抗体结合物主要位于感染细胞表面而形成独特的荧光环[15]。本研究分别利用FAMA法和蚀斑减少中和试验评价制备的VZV抗血清效价，FAMA法检测结果显示，3免血清抗体效价最高达1∶16 382；血清中和试验结果显示，3免血清抗体中和效价最高可达1∶256。相关性分析显示，两种检测方法具有明显的相关性。

MMRV滴定方法为完全中和法，要求用特异性抗血清有选择地中和其他病毒成分后，再对待测病毒进行滴度检测[25]。因此，本研究进行了VZV抗血清对异种病毒的特异性干扰试验，结果显示，VZV抗血清对麻疹、风疹和腮腺炎病毒滴度均无干扰，且未见对细胞具有毒性作用。

综上所述，本研究通过家兔免疫制备出高特异性、高效价的VZV抗血清，为VZV感染的临床治疗和病毒感染早期诊断提供了重要的实验工具，也为联合疫苗的滴定奠定了基础。

参考文献:

[4]夏立新,孙跃秋,王梦涵,等. 2021—2022年长春市水痘-带状疱疹病毒流行株基因序列的特征分析[J].中国生物制品学杂志,2023,36(2):183-186+192.

基金资助:吉林省科技发展计划项目(20200404191YY);

文章来源:刘洪涛,孙跃秋,王冲,等.水痘-带状疱疹病毒抗血清的制备及检定[J].中国生物制品学杂志,2024,37(08):983-988.