干眼症（dry eye disease,DED）是一种常见的泪腺、眼表、结膜组织疾病，由泪膜稳定性降低、角膜和结膜炎症反应加重、神经感觉异常所致，临床症状多样，以眼部不适、视力下降为主。DED的患病率逐年升高，现已成为备受关注的公共卫生问题[1]。该病的临床治疗主要包括手术干预、药物（如人工泪液、激素类滴眼液）治疗等，但上述方法均存在不同程度的风险和副作用[2]。目前，学者普遍认为，角膜、结膜炎症反应是DED发病的主要环节[3]。因此，寻找一种能够抑制炎症反应且副作用少的药物，对DED的临床治疗至关重要。

中医药因安全性高、作用广泛等特点而受到学者广泛关注。研究显示，中药及其提取物、单体（如杞菊地黄汤、石斛提取物、刺槐素等）对DED均有明显的治疗作用[4―6]。虎杖苷（polydatin,PD）来自中药虎杖，是一种天然的白藜芦醇苷类成分，具有抑制炎症和氧化反应、抗菌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等作用[7]。Park等[8]研究发现，PD滴眼液能有效缓解DED大鼠的泪液减少、角膜不规则和损伤、泪膜破裂等病变，并可减轻结膜组织的氧化应激和炎症反应，但具体作用机制尚未阐明。有研究指出，当机体内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos‐phate,c AMP）水平升高时，蛋白激酶A(protein kinase A,PKA）/c AMP反应元件结合蛋白（c AMP response ele‐ment binding protein,CREB）信号通路会被激活，促炎性细胞因子的过度表达将被抑制，从而使DED大鼠的眼表炎症有所减轻，眼膜稳定性和角膜完整性得以恢复[9―10]。基于此，本研究以氢溴酸东莨菪碱（scopolamine hydro‐bromide,SCOP）诱导建立DED大鼠模型，基于PKA/CREB信号通路初步探究PD对DED大鼠炎症反应的影响及潜在机制，以期为DED的治疗提供新靶点和新药物。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器包括ST-360型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）、BX53型显微镜（日本Olym‐pus公司）、SLM-7E型裂隙灯（北京九辰智能医疗设备有限公司）、Universal HoodⅢ型凝胶成像系统（美国BD公司）等。

1.2主要药品与试剂

PD对照品（批号B20533，纯度≥98%）、SCOP对照品（批号S302239，纯度98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；PKA抑制剂H-89的对照品（批号B1427，纯度≥98%）购自美国Sigma-Aldrich公司；荧光素钠试纸（批号202203045）购自南京凯基生物科技发展有限公司；过碘酸希夫染色（periodic acid-Schiff staining,PAS）试剂、苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（批号分别为BSBA-4080A、BSBA-4021）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒（批号分别为PI303、PT516、PI328、P0010S）均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源PKA、CREB、磷酸化PKA(phosphorylated PKA,p-PKA）、磷酸化CREB(phos‐phorylated CREB,p-CREB）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体及辣根过氧化酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号分别为12232-1-AP、12208-1-AP、29314-AP、28792-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）均购自美国Proteintech公司。

1.3实验动物

本研究所用实验动物为清洁级SD大鼠，共75只，雄性，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2021-0006。所有大鼠均饲养于温度20～23℃、相对湿度50%～60%、每12 h明暗循环的动物房内，自由摄食、饮水。本研究方案经天津医科大学眼科医院医学伦理委员会批准（伦理批准号2023-185）。

2、方法

2.1 DED模型的制备与分组

将适应性喂养1周的75只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组（Normal组）、模型组（单纯DED组）、0.05%PD组、0.5%PD组和0.5%PD+PKA抑制剂H-89组（0.5%PD+H-89组），每组15只。除Normal组外，其余各组大鼠均采用眼球表面注射SCOP 12.5 mg/d的方式制备DED模型，每天注射4次（分别为上午9、12时和下午3、6时注射），每只眼睛5μL，连续注射7 d[5]。在造模期间，保持动物房内空气流通并维持相对湿度为50%～60%。若检测到造模大鼠的泪液分泌量减少、结膜组织杯状细胞密度降低、角膜荧光染色增多（具体检测方法见后文），则表明模型复制成功。

2.2给药

在注射SCOP的同时（每天上午9、12时和下午3时），0.05%PD组、0.5%PD组大鼠分别以0.05%、0.5%的PD（用生理盐水为溶剂）滴眼，每天3次（每天上午9、12时，每只眼睛5μL；下午3时，每只眼睛10μL）+腹腔注射生理盐水（体积同H-89），每天1次，共7 d[8];0.5%PD+H-89组大鼠同法以0.5%的PD滴眼，每天3次+腹腔注射H-89（以生理盐水为溶剂）1 mg/kg，每天1次，共7 d[9]。Normal组和单纯DED组大鼠同法以生理盐水滴眼+腹腔注射同体积生理盐水，共7 d。

2.3大鼠泪液分泌量检测

末次给药后，采用泪腺分泌实验检测各组大鼠的泪液分泌量。将经酚红浸润的棉线放置在距离大鼠外眼角约1/3处的下穹隆内，60 s后拔出，记录棉线红色部分的长度（mm），以此表示大鼠的泪液分泌量。

2.4大鼠角膜组织上皮损伤情况评估

采用荧光素染色法检测。泪液分泌实验结束后，将荧光素钠试纸用生理盐水浸湿，备用。随机选取每组5只大鼠，用试纸尖端轻触其下眼睑内侧并停留片刻，在3次手动眨眼后于裂隙灯钴蓝光下观察大鼠角膜的染色情况。将其每个角膜分为4个象限，采用4点评分法对每个象限的角膜组织上皮损伤情况进行评分，具体标准为：绿色染色缺失，记0分；绿色染色呈点状且分散，记1分；绿色染色为成群点状，记2分；绿色染色呈片状，记3分；4个象限的得分总和即为大鼠角膜荧光素染色评分，评分越高，表明角膜组织上皮损伤越严重[11]。

2.5大鼠结膜组织杯状细胞密度检测

采用PAS法检测。角膜组织上皮损伤情况评估完成后，将所有大鼠脱颈椎处死，取其结膜组织适量，于4%多聚甲醛中固定48 h后，行常规石蜡包埋、连续切片，制备结膜组织切片。经PAS后，在显微镜下观察大鼠结膜组织杯状细胞的形态并拍照，计算各组大鼠结膜组织杯状细胞的密度（即每100μm2结膜组织内杯状细胞的个数）。

2.6大鼠角膜组织病理损伤观察

采用HE染色法观察。选取每组另5只大鼠的角膜组织适量，于4%多聚甲醛中固定48 h后，行常规石蜡包埋、连续切片，制备角膜组织切片。经HE染色后，在显微镜下观察大鼠角膜组织的病理损伤情况并拍照。每组剩余5只大鼠的角膜组织于-80℃下冻存，备用。

2.7大鼠角膜组织中炎症因子水平检测

采用ELISA法检测。取“2.6”项下冻存的各组大鼠角膜组织适量，加入生理盐水研磨，制备组织悬液。离心后取上清液，根据相应试剂盒说明书方法，使用酶标仪检测大鼠角膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.8大鼠角膜组织中通路相关蛋白表达情况检测

采用Western blot法检测。取“2.6”项下冻存的各组大鼠角膜组织适量，采用RIPA蛋白裂解液提取其角膜总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后进行变性处理。取变性蛋白适量，进行凝胶电泳分离后以湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜上，用脱脂奶粉封闭；加入PKA、CREB、p-PKA、p-CREB、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4℃下孵育过夜；再加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温下孵育2 h；然后滴加ECL试剂显影，使用凝胶成像系统采集图像，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的条带灰度值比值表示各目的蛋白的表达水平，以p-PKA与PKA、p-CREB与CREB蛋白的表达水平比值表示PKA、CREB蛋白的磷酸化水平。

2.9统计学方法

采用Graph Pad Prism 7.0软件对数据进行统计分析。数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 PD对DED大鼠泪液分泌量的影响

与Normal组比较，单纯DED组大鼠的泪液分泌量显著减少（P<0.05）。与单纯DED组比较，0.05%PD组、0.5%PD组大鼠的泪液分泌量均显著增加，且0.5%PD组显著多于0.05%PD组（P<0.05）。与0.5%PD组比较，0.5%PD+H-89组大鼠的泪液分泌量显著减少（P<0.05）。结果见表1。

表1各组大鼠泪液分泌量、角膜荧光素染色评分和结膜组织杯状细胞密度比较

3.2 PD对DED大鼠角膜组织上皮损伤的影响

与Normal组比较，单纯DED组大鼠角膜组织中的绿色荧光明显增多，其角膜荧光素染色评分显著升高（P<0.05）。与单纯DED组比较，0.05%PD组、0.5%PD组大鼠角膜组织中的绿色荧光均有所减少，其角膜荧光素染色评分均显著降低，且0.5%PD组显著低于0.05%PD组（P<0.05）。与0.5%PD组比较，0.5%PD+H-89组大鼠角膜组织中的绿色荧光明显增多，其角膜荧光素染色评分显著升高（P<0.05）。结果见表1、图1。

3.3 PD对DED大鼠结膜组织杯状细胞密度的影响

与Normal组比较，单纯DED组大鼠的结膜组织杯状细胞密度显著降低（P<0.05）。与单纯DED组比较，0.05%PD组、0.5%PD组大鼠的结膜组织杯状细胞密度均显著升高，且0.5%PD组显著高于0.05%PD组（P<0.05）。与0.5%PD组比较，0.5%PD+H-89组大鼠的结膜组织杯状细胞密度显著降低（P<0.05）。结果见表1、图2。

3.4 PD对DED大鼠角膜组织病理损伤的影响

Normal组大鼠角膜组织上皮细胞发育良好，基质层细胞排列紧密、形态正常，未见明显病变。与Normal组比较，单纯DED组大鼠角膜组织上皮层增厚，基质层细胞排列紊乱、疏松且部分缺失，核间距较大，有大量炎症细胞浸润。与单纯DED组比较，0.05%PD组、0.5%PD组大鼠角膜组织基质层细胞排列稍紧密、核间距缩小，炎症细胞浸润减少，病理损伤有所恢复，其中0.5%PD组大鼠的病理损伤恢复更为明显。与0.5%PD组比较，0.5%PD+H-89组大鼠的角膜组织病理损伤严重，炎症细胞浸润明显。结果见图3。

3.5 PD对DED大鼠角膜组织中炎症因子水平的影响

与Normal组比较，单纯DED组大鼠角膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均显著升高（P<0.05）。与单纯DED组比较，0.05%PD组、0.5%PD组大鼠角膜组织中上述炎症因子水平均显著降低，且0.5%PD组显著低于0.05%PD组（P<0.05）。与0.5%PD组比较，0.5%PD+H-89组大鼠角膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均显著升高（P<0.05）。结果见表2。

图1各组大鼠角膜组织上皮损伤的裂隙灯图像（荧光素染色）

图2各组大鼠结膜组织杯状细胞观察的显微图（PAS)

图3各组大鼠角膜组织病理损伤观察的显微图（HE染色）

箭头：炎症细胞。

表2各组大鼠角膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平比较

3.6 PD对DED大鼠角膜组织中通路相关蛋白表达的影响

与Normal组比较，单纯DED组大鼠角膜组织中PKA、CREB蛋白的磷酸化水平均显著降低（P<0.05）。与单纯DED组比较，0.05%PD组、0.5%PD组大鼠角膜组织中PKA、CREB蛋白的磷酸化水平均显著升高，且0.5%PD组显著高于0.05%PD组（P<0.05）。与0.5%PD组比较，0.5%PD+H-89组大鼠角膜组织中PKA、CREB蛋白的磷酸化水平均显著降低（P<0.05）。结果见表3、图4。

表3各组大鼠角膜组织中通路相关蛋白表达情况比较

图4各组大鼠角膜组织中通路相关蛋白表达的电泳图

4、讨论

DED的发病机制较为复杂，主要与炎症反应，泪膜成分及其稳定性、完整性密切相关[12]。DED会促进炎症反应的发生，可通过激活炎症相关信号通路而进一步加重炎症反应；同时，炎症反应也会刺激眼表，进而加重DED症状[13]。现阶段，临床尚无根治DED的特效药物，只能依靠人工泪液或外科手术来帮助患者缓解眼部不适。因此，探究治疗DED且能缓解炎症反应的新型、安全药物，已成为医药领域研究的热点之一。本研究通过眼球表面注射SCOP制备DED大鼠模型，结果显示，与Normal组比较，单纯DED组大鼠的泪液分泌量、结膜组织杯状细胞密度均显著减少或降低，角膜荧光素染色评分和角膜组织中炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）水平均显著升高，角膜组织上皮层增厚，基质层细胞排列紊乱、疏松且部分缺失，核间距较大，存在大量炎症细胞浸润。这说明大鼠角膜、结膜组织均存在明显的病理损伤，炎症反应严重，具有典型的DED症状，提示DED模型复制成功。

PD是来自虎杖的天然活性成分，具有良好的抗炎作用，在炎症性疾病中得到了广泛的应用。曹瑾等[14]研究发现，PD能够缓解DED大鼠的眼表功能障碍。本研究发现，经0.05%、0.5%的PD干预后，DED大鼠的泪液分泌量、结膜组织杯状细胞密度均较单纯DED组显著增多或升高，角膜荧光素染色评分和角膜组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均较单纯DED组显著降低，角膜组织基质层细胞排列稍紧密、核间距缩小，炎症细胞浸润减少，病理损伤有所恢复，与Park等[8]的研究结果基本一致。这提示PD对DED具有一定的改善作用，可缓解干眼症状，抑制炎症反应的发生。

PKA是G蛋白偶联受体家族成员，被激活后可调控下游CREB蛋白的磷酸化，从而抑制炎症因子的分泌和表达，对炎症性疾病具有较好的干预作用[15]。Cammalleri等[16]研究发现，加巴喷丁可通过调节PKA/CREB信号通路来增加DED兔泪液的分泌。本研究发现，单纯DED组大鼠角膜组织中PKA、CREB蛋白的磷酸化水平均较Normal组显著降低，说明PKA/CREB信号通路在DED大鼠中处于失活状态；经0.05%、0.5%的PD干预后，大鼠角膜组织中PKA、CREB蛋白的磷酸化水平均较单纯DED组显著升高，表明PKA/CREB信号通路被激活。为验证该信号通路在PD改善DED大鼠炎症反应中的作用，本研究在0.5%PD的基础上联用了PKA抑制剂H-89，结果显示，H-89逆转了PD对DED大鼠炎症反应及相关因子或蛋白的改善作用，初步证实了PD可能通过激活PKA/CREB信号通路来减轻DED大鼠的炎症反应。

综上所述，PD可增加DED大鼠的泪液分泌量和结膜组织杯状细胞密度，减轻其角膜组织炎症反应和病理损伤，上述作用可能与激活PKA/CREB信号通路有关。然而，PD对DED大鼠的干预作用机制研究尚不充分，还需进一步探究其他途径。

参考文献:

[4]林忠嗣,于晓斌,张正,等.杞菊地黄汤加减联合中药熏蒸治疗干眼症及对泪液IL-6､MMP-9水平的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(7):133-138.

[5]白雪,刘艳茹,王海.刺槐素通过调控TLR4通路对干眼症大鼠的保护作用及其机制研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2022,24(7):2740-2747.

[9]陈敬君,马贤聪,杨泉,等.芍药苷调控环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白通路对脑卒中大鼠的影响[J].安徽医药,2022,26(6):1073-1078.

[11]姚倩,田蕴霖,周歆,等.环孢素A滴眼液联合维生素A治疗大鼠干眼症的效果及作用机制[J].山东医药,2020,60(16):26-29.

[14]曹瑾,龚兰兰,吕旭东.虎杖苷激活MEK/ERK信号通路改善东莨菪碱诱导的干眼症大鼠眼表功能障碍和病变[J].中国免疫学杂志,2024,40(5):1089-1095.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82070929);天津市医学重点学科(专科)建设项目(No.TJYXZDXK-037A);

文章来源:赵丽琼,魏瑞华.虎杖苷对干眼症大鼠炎症反应的影响及机制[J].中国药房,2024,35(18):2213-2218.