首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 脑胶质瘤论文 > 基于生信分析探究TMEM16A的表达对胶质瘤的影响及实验验证

基于生信分析探究TMEM16A的表达对胶质瘤的影响及实验验证

2024-10-03 68 上传者：管理员

摘要：目的探究TMEM16A在胶质瘤中的生物信息学功能及临床意义。方法利用TIMER2.0和GEPIA数据库进行泛癌分析，评价TMEM16A在肿瘤组织与正常组织中的表达差异；使用GEPIA和CGGA数据库研究TMEM16A的表达对胶质瘤患者预后的影响；利用GeneMANIA和STRING数据搭建蛋白互作网络，筛选互作蛋白；通过富集分析研究TMEM16A相关的信号通路和生物学功能；通过TIMER2.0数据库对TMEM16A与免疫细胞浸润表达水平的相关性进行研究，以评价其对肿瘤微环境的影响，然后使用MTT实验进行验证。结果 TMEM16A在众多肿瘤中表达上调，对胶质瘤的进展具有促进作用，可以作为胶质瘤的独立预后因子，在蛋白互作网络中证明TEMEM16A与CFTR相互作用，共同调节胶质瘤细胞的进展；富集分析进一步显示了TMEM16A在胶质瘤中作用的分子机制，TMEM16A在TNF、AMPK信号通路上富集，与肿瘤免疫微环境相关；免疫细胞浸润水平结果表明，TMEM16A与多种免疫细胞的浸润水平呈显著正相关。体外实验结果证实，TMEM16A的抑制剂能够有效降低胶质瘤细胞的增殖。结论 TMEM16A的表达与胶质瘤的进展相关，TMEM16A可能是治疗胶质瘤的潜在靶点，可作为胶质瘤治疗的生物标志物。

关键词：
Tmem16a
免疫浸润
强侵袭性
胶质瘤
预后价值
加入收藏

胶质瘤是一种具有强侵袭性、致死性的恶性脑肿瘤，其中胶质母细胞瘤(GBM)的发病率占所有胶质瘤的50%[1],占所有颅内肿瘤的16%[2],若不进行治疗患者的生存时间仅有6个月[3]。有研究报道，基因突变、环境变化等是诱发胶质瘤的重要因素[4],因此，详细探究胶质瘤中差异表达的基因，对其早期诊断以及提供新药研发方向具有非常重要的意义。TMEM16A(又称ANO1)是一个参与众多生理活动的蛋白，在许多肿瘤细胞中异常表达，如头颈部鳞状细胞癌[5]、胰腺癌[6]、胃肠道癌[7]、乳腺癌[8]、胶质瘤[9]等。本研究通过生物信息技术，对TMEM16A的异常表达与胶质瘤患者的预后、生存以及肿瘤微环境的关系进行研究，并对结果进行实验验证，旨在为胶质瘤的临床治疗提供新的方向。

1、材料与方法

1.1材料

U251细胞(人胶质瘤细胞)、U-87 MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞)购自上海碧云天生物技术有限公司，CaCCinh-A01购自上海陶术生物科技有限公司，MTT(甲基噻唑蓝溶液)购自武汉赛维尔生物科技有限公司，DMSO(二甲亚砜)购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1 TMEM16A的表达差异分析

使用TIMER(https: //www.timeanddate.com/timer/)数据库对TMEM16A在多种肿瘤组织中和正常组织中的表达差异进行分析，然后，利用GEPIA(http: //gepia.cancer-pku.cn/)数据库对TMEM16A在胶质瘤组织中与正常组织中的表达进行了分析；最后，通过UALCAN(http: //ualcan.path.uab.edu/)数据库[10]研究胶质瘤中与TMEM16A表达相关的临床病理学参数。

1.2.2生存分析

通过GEPIA(http: //gepia.cancer-pku.cn/)和CGGA(http: //www.cgga.org.cn/)数据库分析TMEM16A对胶质瘤患者生存的影响，使用R软件包survival(version 3.2-7)的coxph函数分析基因表达与每个肿瘤的预后关系，使用Logrank test进行统计检验，研究TMEM16A的表达对胶质瘤患者预后的影响。

1.2.3相互作用网络的搭建

在GeneMANIA(http: //gene-mania.org)数据库中绘制TMEM16A相关基因网络图；在STRING(https: //cn.string-db.org/)中生成蛋白相互作用网络图；然后，通过维恩在线工具(https: //jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html)获取两个网络中的交集基因。

1.2.4基因富集分析

通过整理TCGA(https: //www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga)数据库的相关数据，使用LinkedOmics(https: //linkedomics.org/login.php)数据库[11],获得TMEM16A共表达基因，并对其进行KEGG富集分析和GO功能分析。

1.2.5免疫浸润水平分析

通过TIMER2.0(http: //timer.cistrome.org/)的SCNA模块分析TMEM16A不同体细胞拷贝数的变化与胶质瘤的免疫浸润关系，检验在胶质瘤组织与正常组织相比基因不同拷贝状态对免疫浸润的影响，包括臂级删除、二倍体/正常、臂级增益以及高扩增，使用双向Wilcoxon秩和检验将每个SCNA类别的渗透水平与正常水平进行比较。通过TIMER2.0数据库[12]分析TMEM16A与肿瘤微环境的关系。

1.2.6细胞培养

U251细胞、U-87 MG细胞在含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，放入37℃、5% CO2的常规细胞培养箱中培养。

1.2.7 MTT(噻唑蓝比色法)实验

将U251细胞和U-87 MG细胞分别接种于96孔板中，培养24h。第2d,在细胞中加入梯度浓度的CaCCinh-A01(TMEM16A抑制剂[13-14]),在常规培养箱培养48h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)再孵育4h。然后弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO溶解甲瓒，在490nm处的吸光度由酶标仪测定。

1.3统计学方法

使用Graphpad prism 8.2软件进行分析，两组之间比较使用独立样本t检验，两组以上的样本比较使用单因素方差分析，P<0.05即认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 TMEM16A在肿瘤组织中的表达

对TMEM16A的泛癌表达分析显示，TMEM16A在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、结肠癌(COAD)等多种肿瘤中表达上调(图1A),表明TMEM16A表达上调与多种肿瘤相关。在胶质瘤中，发现在正常组织中与低级别胶质瘤(LGG)、GBM组织中TMEM16A的表达没有显著差异(图1B、C)。通过CGGA数据库分析TMEM16A在不同WHO病理分级的胶质瘤中的表达，结果发现，TMEM16A的表达随着分级的上升逐渐增加(图2A),提示TMEM16A的异常表达可能与胶质瘤的进展相关[15]。对TMEM16A在各级别原发性肿瘤和继发性肿瘤中的表达进行分析，如图2B所示，在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中，TMEM16A在继发肿瘤中表达均显著上调。

此外，如图2C所示，TMEM16A的表达在Ⅲ级IDH野生型胶质瘤中表达显著上调，但是，1p19q共缺失和非共缺失状态的TMEM16A的表达并没有显著差异(图2D)。

总之，TMEM16A的高表达可能促进了低级别胶质瘤向高级别转化的进程。

图1 TMEM16A在肿瘤组织和正常组织中的表达情况

图2 TMEM16A的表达与肿瘤分期的相关性

2.2 TMEM16A的表达与胶质瘤患者生存预后的关系

如图3A、B结果显示，TMEM16A的表达对胶质瘤患者总生存期(OS)的影响不具有统计学意义(P>0.05)。发现TMEM16A表达上调显著降低了原发性和继发性胶质瘤患者的生存时间(图3C、D)。此外，建立预后模型，如图4,结果发现TMEM16A高表达与胶质瘤(GBMLGG)患者(N=857,P=4.0e-9,HR=1.32)预后不良显著相关，但是TMEM16A的高表达对LGG患者的预后不良并无显著影响，TMEM16A的高表达与GBM(N=196,P=3.6e-4,HR=1.24)患者的预后不良显著相关。由此可知，TMEM16A的高表达会显著降低胶质瘤患者的生存时间，并与胶质瘤患者的预后不良显著相关。

图3 TMEM16A的表达对胶质瘤患者预后的影响

图4 TMEM16A的表达对胶质瘤(GBMLGG)患者的预后分析

2.3 TMEM16A相互作用网络的构建

由图5A所示，TMEM16A主要与CFTR、ANO3、ANO6、ANO5、ANO2、ANGEL1等基因存在相互作用；蛋白质互作网络分析结果显示，TMEM16A主要与BRIP1、RTEL1、CLCA2、CLCA4、CALD1、CD34、PDGFRA、CFTR等蛋白存在相互作用关系(图5B),通过两个网络靶点进行交集，确定CFTR可能是TMEM16A作用的潜在靶点(图5C),据报道，CFTR通过上调Akt/Bcl2介导的抗凋亡途径促进胶质瘤的进展[16],因此，TMEM16A可能与CFTR相互作用，共同参与促进胶质瘤的发生和发展进程。

图5 TMEM16A相互作用网络图

A.TMEM16A基因互作网络；B.TMEM16A蛋白互作网络；C.基因网络与蛋白网络韦恩图。

2.4 TMEM16A相关生物过程与功能富集分析

对TMEM16A进行富集分析，结果表明，在胶质瘤中，TMEM16A在白细胞的活动、血管生成、淋巴细胞介导免疫、RNA分解代谢、信使RNA加工以及核糖核蛋白复合体生物发生等过程中高度富集(图6A)。此外，通过KEGG分析可见，TMEM16A在TNF、AMPK以及细胞因子等通路高度富集(图6B)。由此可见，TMEM16A与胶质瘤的发生、免疫浸润相关。

图6富集分析

A.GO富集分析TMEM16A在胶质瘤中主要的生物过程分析；B.KEGG分析TMEM16A在胶质瘤中主要参与的信号通路。

2.5 TMEM16A与免疫细胞的关系

对胶质瘤中TMEM16A不同拷贝状态与6种免疫细胞浸润水平的关系进行分析。如图7A所示，在LGG样本中TMEM16A臂级删除与B细胞的浸润水平显著高于TMEM16A二倍体正常样本，TMEM16A臂级增益的胶质瘤样本与6种免疫细胞的浸润水平均显著低于正常样本。而在GBM样本中TMEM16A高扩增与CD4+、树突细胞的浸润水平显著降低，TMEM16A的臂级增益样本与树突细胞的浸润水平显著降低(图7B)。分析TMEM16A的表达与6种免疫细胞浸润水平的相关性，由图8A所知，TMEM16A在LGG中的表达与六种免疫细胞的浸润水平均呈正相关，而在GBM中，TMEM16A的表达与巨噬细胞、树突细胞的浸润水平呈正相关，其余为负相关(图8B)。由此可见，TMEM16A可能是胶质瘤中的肿瘤免疫浸润调节因子。

图7在胶质瘤中TMEM16A不同体细胞拷贝状态下与免疫细胞浸润水平的关系

A.TMEM16A在LGG中不同体细胞拷贝状态下与免疫细胞的浸润水平的关系；B.TMEM16A在GBM中不同体细胞拷贝状态下与免疫细胞的浸润水平的关系。

图8免疫浸润相关性分析

2.6 CaCCinh-A01可抑制胶质瘤的增殖

为了对结论进行验证，本研究选择了一种有效的TMEM16A抑制剂CaCCinh-A01处理U251细胞、U-87 MG细胞。由图9所示，使用CaCCinh-A01处理2种胶质瘤细胞48h后，细胞收缩变圆(图9A、图9C),细胞的存活率均出现了显著的下降，其中U251细胞比U-87 MG细胞对CaCCinh-A01的敏感性更高(图9B、图9D),由此可知，使用TMEM16A的抑制剂可显著抑制胶质瘤细胞的增殖，TMEM16A的表达对胶质瘤的发生发展具有促进作用，与上述预测结论一致。

图9 CaCCinh-A01对胶质瘤细胞系生长的影响

3、讨论

TMEM16A在人体组织中广泛表达，并且参与众多生理过程[17]。有研究证实，TMEM16A对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等方面具有促进作用[18]。因此，通过干预TMEM16A的表达能够有效的抑制胶质瘤的发展。

在本研究中，通过公共数据库中对TMEM16A的表达差异进行分析，结果显示TMEM16A在众多肿瘤中均显示高表达，在胶质瘤中，随着WHO病理分级的升高，TMEM16A的表达增加，在原发性和继发性Ⅲ、Ⅳ胶质瘤中的表达同样显著升高，提示其可能与胶质瘤的进展相关。在生存分析中，TMEM16A的表达越高，胶质瘤患者的生存时间越短，并且TMEM16A的高表达与胶质瘤患者的预后不良显著相关。由此，推测TMEM16A的高表达对胶质瘤的进展具有促进作用，并且其可能与其他相关基因具有协同作用，于是构建了TMEM16A的基因互作网络和蛋白互作网络图，并通过交集后发现了互作靶点蛋白CFTR,推测TMEM16A可能是通过与CFTR相互作用起到促进胶质瘤进展的作用，随后，通过对TMEM16A的富集分析发现，TMEM16A在白细胞的活动、血管生成、淋巴细胞介导免疫、RNA分解代谢、mRNA加工以及核糖核蛋白复合体生物发生等生物过程高度富集，其中核糖核蛋白复合体生物发生以及血管生成都是肿瘤细胞进行分裂生长所必须的过程[19],在恶性肿瘤发生和发展中，RNA的转录翻译发生异常是非常关键的步骤，并且异常转录翻译的RNA是肿瘤标志物潜在位点[20],由此可见，TMEM16A与胶质瘤的发生和发展都存在密切的关系。KEGG结果发现，TMEM16A富集的通路TNF、AMPK均与细胞免疫相关，并且先天免疫系统和适应性免疫对于抗肿瘤非常关键[21],因此，对TMEM16A与免疫细胞浸润丰度进行分析，发现无论是在LGG中还是GBM中TMEM16A的表达均与多种免疫细胞呈正相关，这些结果表明，TMEM16A在调节胶质瘤的肿瘤免疫微环境中具有重要的意义，对胶质瘤的发生发展起到促进作用。另外，MTT实验结果表明，TMEM16A的抑制剂CaCCinh-A01可以显著降低胶质瘤细胞的增殖。因此，可以将干预TMEM16A的表达抑制肿瘤的生长作为新药研发方向。

总之，TMEM16A的表达与胶质瘤的进展密切相关，可能是胶质瘤的潜在生物靶点，对胶质瘤患者的治疗存在重要的临床价值。

基金资助:2020年湖北科技学院博士启动基金项目(BK202120);

文章来源:霍盟盟,王紫薇,郭婉莹,等.基于生信分析探究TMEM16A的表达对胶质瘤的影响及实验验证[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(05):394-399.