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基于网络药理学和细胞实验探索柳穿鱼黄素对前列腺癌细胞的作用

2024-10-03 53 上传者：管理员

摘要：目的采用网络药理学、分子对接和细胞实验，探索柳穿鱼黄素对前列腺癌细胞潜在靶点和对细胞增殖、迁移、侵袭的影响及作用机制。方法首先通过数据库筛选柳穿鱼黄素的成分靶点以及前列腺癌相关的疾病靶点，以此来构建药物-靶点-疾病可视化网络和蛋白相互作用网络(PPI),进行GO和KEGG富集分析，采用分子对接软件对潜在的作用靶点进行验证。采用不同浓度的柳穿鱼黄素处理前列腺癌细胞，通过MTT测定和平板克隆形成证明柳穿鱼黄素在前列腺癌细胞增殖中的抑制作用，通过划痕实验以及Transwell侵袭迁移实验证明其侵袭迁移能力。结果网络药理学结果显示柳穿鱼黄素抗前列腺癌的靶点共有62个，KEGG富集分析发现柳穿鱼黄素通过癌症通路、PI3K-AKT等多种信号通路发挥抗前列腺癌的作用；分子对接显示柳穿鱼黄素与主要靶点之间具有良好的结合活性；与空白对照组相比，体外细胞实验结果显示柳穿鱼黄素能显著降低前列腺癌细胞活性，并且其增殖、迁移能力显著降低。结论柳穿鱼黄素可能通过多种靶点抑制前列腺癌细胞增殖。经体外细胞实验验证表明，随着柳穿鱼黄素浓度增加，前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力被抑制。

关键词：
分子对接
前列腺癌细胞
增殖
柳穿鱼黄素
网络药理学
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前列腺癌被认为是西方国家男性发病率最高的癌症且在老年男性中最为常见，是全球范围内男性癌症死亡的第二大原因[1]。随着人口老龄化趋势的加剧，我国前列腺癌的发病率也在逐年上升[2]。目前，前列腺癌的治疗主要包括手术切除、放疗和激素治疗[3]。然而，化疗和放疗在晚期癌症的治疗中效果并不理想，因此，迫切需要开发更有效、更安全的药物来提高患者的生存率。柳穿鱼黄素是一种天然黄酮类化合物，提取于传统中药大蓟[4]。据文献[5]报道，柳穿鱼黄素具有抗癌、抗炎和抗氧化的作用。近年来的研究[6]表明，柳穿鱼黄素能够抑制多种癌症，如肝细胞癌、乳腺癌和骨肉瘤等，然而在前列腺癌中的作用尚未有相关报道。因此，本研究旨在通过网络药理学和体外细胞实验来探究柳穿鱼黄素对人前列腺癌Pc3细胞的抑制作用。

1、材料与方法

1.1材料

人前列腺癌Pc3细胞(servicebio公司),柳穿鱼黄素(南京广润生物制品有限公司，GR-138-210402,HPLC≥98%),1640培养基(servicebio公司),FBS(索莱宝公司),胰酶(Biosharp公司),CO2培养箱(ESCO公司),荧光显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1柳穿鱼黄素靶点的筛选

以“Pectolinarigenin”为关键词，应用药物靶点数据库BATMAN(http: //bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm),获得柳穿鱼黄素药物结构，通过PubChem、SwissTargetPrediction、Targetnet和PharmMapper数据库预测柳穿鱼黄素的靶点，删除重复部分。所有靶蛋白的名称均从UniProt数据库中校正而来，校正后的靶蛋白统称柳穿鱼黄素的潜在靶蛋白。

1.2.2前列腺癌疾病靶点的筛选

以“prostate cancer”为关键词，基于Gene Cards(https: //www.genecards.org)、OMIM(http: //www.omim.org)数据库查找前列腺癌相关靶点，并且以前列腺癌靶点和柳穿鱼黄素预测靶点绘制韦恩图。

1.2.3构建柳穿鱼黄素靶点网络及构建蛋白相互作用网络

运用STRING数据库构建一个PPI网络图，该图展示了药物与疾病之间的共同靶点。再通过Cytoscape(3.8.1)软件对PPI网络进行可视化分析及处理。

1.2.4 GO功能富集与KEGG通路富集分析

将交集靶点导入DAVID数据库(http: //david.ncifcrf.gov),设置物种为“Homo sapiens”,为了确保结果的可靠性，我们设置了显著性水平为P<0.05。此外，利用R语言进行可视化分析得到气泡图。

1.2.5柳穿鱼黄素与关键作用靶点分子对接

关键作用靶点蛋白从蛋白数据库PDB(https: //www.rcsb.org)中获得。运用AutoDock Vina 1.5.6软件，将柳穿鱼黄素与其主要作用靶点进行了分子对接。在众多对接模式中，我们筛选出结合能最低的模式，以便进一步深入研究。随后，利用Pymol软件对最佳结果进行绘图。

1.2.6细胞培养及增殖能力检测

在含有10%血清的1640培养基、无菌培养箱中培养Pc3细胞，待细胞状态良好时进行实验。

取对数生长期的Pc3细胞，96孔板中每孔铺8000个细胞。当培养到每孔密度为80%时，加入浓度为0、5、10、20、40、80μmol/L的柳穿鱼黄素处理24h后，再加入MTT溶液培养4h,每孔加150μL的DMSO溶液，并在摇床上摇晃30min以促使溶解。用酶标仪测量OD值。通过公式计算细胞抑制率=(药物组OD值/对照组OD值)×100%。实验重复3次。

1.2.7细胞平板克隆形成

取对数生长期的Pc3细胞，按每孔1500个细胞均匀铺于6孔板中，24h后，配制浓度梯度为0、5、10、20μmol/L的含药培养基，放入培养箱中培养10～14d,在显微镜下观察，观察细胞形成独立的细胞群落，终止培养，随后，使用PBS对细胞进行2～3次清洗，然后在预冷的甲醛中固定20min。接着，使用0.1%结晶紫染色处理20min,清洗去除多余染料后，拍摄图像。实验重复3次。

1.2.8划痕实验

在6孔板中接种2×105个/孔Pc3细胞，待细胞生长至90%时进行划痕实验。每孔分别添加浓度为0、20、40、80μmol/L的柳穿鱼黄素2mL,24h后拍照。使用Image J软件测量细胞迁移面积，分析细胞伤口愈合面积，计算细胞迁移率：细胞迁移率=(0h划痕面积-24h划痕面积)/0h划痕面积×100%。实验重复3次。

1.2.9 Trannswell侵袭与迁移实验

将Pc3细胞在无血清培养基饥饿6h,侵袭组加基质胶，迁移组不加，培养箱放置30min,之后上室每孔加10万细胞，下室分别加浓度为0、20、40、80μmol/L的柳穿鱼黄素，每孔0.5mL,24h结晶紫染色后拍照计数。实验重复3次。

1.3统计学方法

使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析并绘图，数据结果以表示，并用One-Way ANOVA分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1柳穿鱼黄素抗前列腺癌作用靶点

将筛选出的166个柳穿鱼黄素靶点、2259个前列腺癌靶点相交，共得出62个交集靶点，即柳穿鱼黄素的抗前列腺癌靶点，如图1所示。

图1柳穿鱼黄素与前列腺癌靶点交集韦恩图

2.2共同靶点蛋白互作网络图

柳穿鱼黄素抗前列腺癌作用的靶点通过STRING数据库进行PPI网络分析，并使用Cytoscape进行可视化处理。在图2中，蛋白互作图中的节点颜色越深表示该节点的度值越高，同时结合分数也越大，通过拓扑分析得到61个关键靶点，top10的基因如表1所示，分别为EGFR、AKT1、ESR1、HSP90AB1、PTGS2、MMP9、PPARG、PARP1、GSK3B、SIRT1。

图2柳穿鱼黄素抗前列腺癌的PPI蛋白互作网络图

表1柳穿鱼黄素抗前列腺癌的拓扑学参数(前10)

2.3 GO功能富集与KEGG通路分析

借助DAVID数据库(https: //david.ncifcrf.gov)平台进行GO与KEGG富集分析，设置阈值P<0.05进行筛选，整理分析数据，利用R语言进行网络可视化。图3～4显示，主要涉及的生物学过程(BP)主要有细胞凋亡的负调控、蛋白磷酸化、细胞增殖的正调控等，涉及的细胞组分(CC)主要有细胞膜、细胞质、细胞核等，涉及的分子功能(MF)主要有ATP结合蛋白丝氨酸酪氨酸激酶活性等，主要富集的信号通路有癌症通路、PI3K-AKT信号通路等。

图3柳穿鱼黄素抗前列腺癌的GO功能富集分析

图4柳穿鱼黄素抗前列腺癌的KEGG通路富集分析

2.4柳穿鱼黄素与核心靶点的分子对接分析

将柳穿鱼黄素与核心靶点AKT1进行分子对接，结合能数据为-9.4kcal/mol,如图5。一般认为，结合能<-5.0kcal/mol,说明两者具有较好的结合活性，表明小分子柳穿鱼黄素与核心靶点蛋白AKT1结合性较好。

图5柳穿鱼黄素抗前列腺癌关键靶点AKT1分子对接图

2.5柳穿鱼黄素抑制前列腺癌Pc3的增殖

用MTT实验检测柳穿鱼黄素对前列腺癌细胞Pc3的增殖能力。实验结果如图6所示，随着柳穿鱼黄素给药浓度增加，细胞数量明显减少，细胞活力变差。说明柳穿鱼黄素可以抑制前列腺癌细胞的增殖。

图6柳穿鱼黄素对Pc3细胞增殖的影响(×10)

2.6柳穿鱼黄素抑制前列腺癌细胞的克隆形成

用平板克隆实验检测柳穿鱼黄素对前列腺癌细胞克隆形成能力的影响。实验结果如图7所示，随着柳穿鱼黄素浓度的增加，前列腺癌细胞克隆形成能力逐渐降低。表明柳穿鱼黄素可以抑制Pc3的克隆形成能力且呈剂量依赖性。

图7柳穿鱼黄素对Pc3细胞克隆形成能力的影响

2.7柳穿鱼黄素抑制前列腺癌Pc3细胞的迁移与侵袭能力

划痕试验的结果揭示了Pc3细胞的横向迁移能力，结果如图8所示，24h后Pc3细胞的划痕宽度随浓度的变化而显著增加。空白对照组和20、40和80μmol/L组的Pc3细胞愈合面积分别为51.15%、34.55%、24.82%和15.72%,差异具有显著性(P<0.05),表明柳穿鱼黄素对Pc3细胞的横向迁移能力具有浓度依赖性的抑制作用。迁移实验的结果展示了Pc3细胞的纵向迁移能力受到了柳穿鱼黄素的影响。如图9所示，与空白对照组相比，经过20、40和80μmol/L的柳穿鱼黄素处理后，Pc3细胞的迁移抑制率分别达到了54.04%、44.58%和30.3%。这一数据表明，柳穿鱼黄素对Pc3细胞的纵向迁移能力具有抑制作用，且这种抑制作用随着药物浓度的增加而增强。侵袭实验证明了Pc3细胞的侵袭能力，结果见图10所示，与空白对照组相比，20、40和80μmol/L的Pc3细胞侵袭抑制率分别为66.13%、42.71%、34.28%,表明Pc3细胞的侵袭能力被柳穿鱼黄素抑制。

图8柳穿鱼黄素对Pc3细胞横向迁移能力的影响(×4)

图9柳穿鱼黄素对Pc3细胞纵向迁移能力的影响(×10)

图10柳穿鱼黄素对Pc3细胞纵向侵袭能力的影响(×10)

3、讨论

在一项针对非小细胞肺癌的研究中，柳穿鱼黄素通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制了癌细胞的进展[7]。此外，柳穿鱼黄素还能通过PI3K/AKT/mTOR/ERK信号通路诱导肝癌细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M期，从而有效阻止癌细胞的增殖[8]。另一项研究表明柳穿鱼黄素在调控SHP-1/JAK2/STAT3信号通路方面的潜力，这为其成为治疗骨肉瘤的新型药物提供了理论基础[9]。此外，柳穿鱼黄素可能通过下调PI3K/AKT/mTOR通路，导致人胃癌细胞G2/M期周期阻滞、自噬和凋亡，从而起到抗癌作用[10]。为了更深入地探究柳穿鱼黄素在前列腺癌治疗中的具体作用机制，我们采用了网络药理学方法进行研究，通过KEGG富集分析发现主要富集的信号通路有癌症通路、PI3K-AKT信号通路，并且我们通过柳穿鱼黄素与核心蛋白AKT1分子对接发现其结合活性良好，因此，我们推断柳穿鱼黄素可能通过影响PI3K-AKT信号通路来发挥其抗肿瘤作用。PI3K/AKT信号通路被认为是人类癌症中最重要的致癌途径之一，其中1类与肿瘤的关系最密切，PI3K/AKT信号通路主要作用是促进细胞增殖，抑制凋亡[11],而抑制PI3K-AKT信号通路可以抑制肿瘤细胞的生长，AKT是PI3K-AKT信号通路的重要靶点，当肿瘤发生时，AKT会被激活，进而调控其下游通路，目前AKT已成为研究重点，其几乎在包括转录和蛋白合成，细胞代谢、生长、增殖等每个功能方面并且发挥至关重要的作用，而AKT1也是公认的一种原癌基因，在许多肿瘤中是最主要表达，也是最具有特征的一个亚型[12]。在体外细胞实验中，结果显示柳穿鱼黄素能够有效抑制前列腺癌Pc3细胞的增殖、克隆形成以及迁移能力。这些发现为柳穿鱼黄素在前列腺癌治疗中的应用提供了有力的实验依据。

综上所述，柳穿鱼黄素作为一种潜在的抗癌药物，展现出了广阔的应用前景和巨大的发展潜力，其多种药理活性为前列腺癌治疗提供了新的思路和可能性。然而，本研究仅进行了细胞实验，为探索其研究机制仍需进一步的研究。

参考文献:

[6]赵维维,雷涛.柳穿鱼黄素研究进展[J].中药材,2023,46(3):796

[11]董兰,赵冰洁,曾凤娇,等.马钱子碱抑制骨肉瘤的作用机制[J].湖北科技学院学报(医学版),2023,37(4):277

[12]张丽娟.AKT1/2在去势抵抗性前列腺癌进展中的作用研究[D].新乡:新乡医学院,2019

基金资助:湖北科技学院省级大学生创新创业项目(S202310927021);

文章来源:阮诗剑,蔡敬,谢孟婷,等.基于网络药理学和细胞实验探索柳穿鱼黄素对前列腺癌细胞的作用[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(05):400-404+408.