血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)是构成血管内层的一种特殊类型的扁平细胞，在人体的血液循环系统中起着至关重要的作用。VEC不仅在胚胎发育期间通过血管生成参与器官的形成，而且在成年期通过血管生成参与组织修复和再生，对维持组织稳态和响应损伤修复具有重要作用[1]。新生血管形成是组织损伤修复和再生的关键过程，在人体健康和疾病状态中都具有重要的临床意义；例如，在伤口愈合中能够为创伤部位组织提供必要的氧气和营养[2]，在心肌梗死后的心脏修复过程中有助于改善心脏功能和患者预后[3]。其中VEC的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤[4]。因此关于VEC的增殖和迁移等相关生物学效应的研究，对于相关疾病疗效机制的探索是十分重要的。

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是一种从人血浆中分离纯化制备的血液制品[5]。目前主要用于低白蛋白血症、血容量不足、新生儿高胆红素血症、急性呼吸窘迫综合征和危重症患者等的治疗[6]。近年来，越来越多的研究证据表明HSA在创面修复[7]和心脏手术[8]中也具应用价值，且可能使患者从中获益。目前研究已经证明HSA在上述疾病应用中的主要疗效机制包括：维持胶体渗透压、扩充血容量、改善微循环、抗炎和抗氧化、抗凝血和抗血栓、纠正低白蛋白血症和保护血管内皮糖萼并维持内皮屏障的完整性等[9]。虽然目前并无关于HSA在上述疾病应用中对新生血管生成影响的相关研究报道。但是已有大量研究指出HSA对于维持正常血管内皮功能具有重要意义[10]。我们认为进行HSA对VEC相关的生物学效应的影响研究是非常必要的。

由于血浆来源及生产制备工艺的不同，不同来源的HSA制品的产品质量也存在一定的异质性[11-13]。故我们认为不同来源HSA对VEC生物学效应的影响也可能有所差异。综上，我们拟通过对HUVEC细胞进行体外培养，研究不同来源HSA对VEC的增殖和迁移等生物学效应的影响。以期为HSA在相关疾病的应用探索中提供一定的理论参考。

一、材料与方法

1 HSA样本和HUVEC细胞

1.1 HSA样本

人血浆来源HSA选用国内6家不同血液制品公司生产的pHSA样本，规格为：10 g/瓶(20%，50 mL)。pHSA1，批号：A052202207；pHSA2，批号：20220205A1；pHSA3，批号：20210737；pHSA4，批号：202209092；pHSA5，批号：202203007；pHSA6，批号：202204022。基因重组HSA 选用国内2家不同生物制药公司生产的rHSA样本，规格为：10g/瓶(20%，50 mL)。酵母表达rHSA1，批号：ART102L-230712-01，水稻表达rHSA2，批号：C202208003。

1.2 HUVEC细胞

HUVEC细胞系是从国家生物医学实验细胞资源库——协和细胞库购买。

2 试剂与仪器

2.1 试剂耗材

0.22 μm除菌滤器(Merck Millipore,SLGP233RB)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056)；DMEM/F12培养基(谱诺赛，PM150310)；胎牛血清(MP Biomedicals,Y171020)；青霉素-链霉素(Gibco,15140122)；100 mm细胞培养皿(Corning,430591)；12孔透明未处理多孔板(Corning,3737)；超强型CCK-8试剂盒(碧云天，C0048M)；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，C1052)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，C1062L)；Matrigel基底膜基质(康宁，354234)。

2.2 仪器设备

涡旋仪(Ika,VORTEX 06)；小型离心机(Eppendorf,MiniSpin)；酶标仪(MOLECULARDEVICES,SpectraMax i3x)；离心机(BECKMAN COULTER,Allegra X-I5R Centrifuge)；细胞培养箱(Thermo,348391-15678)；倒置荧光显微镜(Leica,DMI3000B)；垂直流超净工作台(ThermoFisherScientific,1300SERIESA2)；流式细胞仪(FACS-CelestaTM,BD)。

3 实验方法

3.1 HUVEC细胞培养

HUVEC细胞为贴壁细胞，待培养皿中细胞密度达到90%左右时进行传代，2 mL胰酶消化5 min，待细胞成流沙状滑落时加入完全培养基终止消化，离心收集细胞，加入新的HUVEC细胞完全培养基(DMEM/F12培养基+10% FBS+1% P/S双抗)，于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。

3.2 细胞增殖活性检测

接种细胞：在96孔板中接种细胞，采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS溶液，每孔接种数量为20 000/mL细胞悬液100 μL；每组设置3个复孔，纵向排布，横向接种以减小组间差异。在5% CO2条件下37 ℃培养过夜(12 h)。细胞贴壁后，弃去培养基后改用DMEM/F12无血清培养基饥饿处理12 h进行同步化，后分组干预。分组及处理：设置无血清培养基处理对照组，不同来源HSA样本处理实验组(用无血清培养基稀释配制的0.5%不同来源HSA溶液)，各孔按照实验分组每孔加入200 μL处理48 h。细胞增殖活性检测：处理完成后，吸去原始培养基，每孔重新加入100 μL无血清培养基，然后每孔加入超强型CCK-8溶液10 μL继续培养1 h，随后取出96孔板，在酶标仪上测量450 nm吸光值，根据公式计算细胞活力百分比，所有实验重复3次。

3.3 细胞周期检测

细胞处理：根据实验设计在12孔板每孔中加入约6.25×104/mL细胞悬液1 mL，置于培养箱中过夜培养贴壁；细胞过夜贴壁后更换无血清培养基，饥饿培养12 h。根据实验设计在各孔中加入无血清培养基稀释的0.5%的白蛋白溶液和无血清培养基作为对照组连续处理48 h后观察染色后进行下一步实验。染色处理：按照试剂盒说明书要求小心收集细胞并固定，按照说明书制备染色液后进行细胞染色。流式检测和分析：用流式细胞仪进行检测，空白对照组固定后无需染色用于设定电压，每个样品共收集10 000个细胞。在激发波长488 nm 波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。收集流式数据，然后用FlowJo软件分析，比较GO/G1期，S期，G2/M期的变化。

3.4 细胞凋亡检测

细胞处理：同1.3.2细胞处理部分内容。染色处理：按照试剂盒说明书要求小心收集细胞，按照说明书制备染色液后进行细胞染色。流式检测和分析：用流式细胞仪进行检测，每个样品共收集10 000个细胞。Annexin V-FITC发绿色荧光，PI发红色荧光。细胞象限定位分群如下：活细胞(左下，Annexin V-/PI-)，早期凋亡细胞(右下，AnnexinV+/PI-)，晚期凋亡细胞(右上，Annexin V+/PI+)，坏死细胞(左上，Annexin V-/PI+)。

3.5 细胞划痕实验

先用marker笔在12孔板背面均匀划横线，每孔至少穿过2条线；在孔中加入1 mL约2.5×105/mL细胞悬液；置于培养箱中过夜培养贴壁。待细胞密度达到约80%时，更换无血清培养基，饥饿同化处理12 h。同化结束后用枪头比着直尺，尽量垂直孔板于背面的横线划痕。用无血清培养基润洗细胞3次。根据实验设计在各孔中加入无血清培养基稀释的0.5%的白蛋白溶液和无血清培养基作为对照组。放入37 ℃、5% CO2培养箱培养；分别在0、12、24、36 h，显微镜观察特定位置细胞迁移情况并拍照。使用Image J软件打开图片后，计算各图片中划痕的面积，统计分析各处理组及不同时间点划痕愈合情况。

3.6 管形成实验

细胞准备：对于HUVEC细胞，常规培养，保证细胞状态，接种前细胞处于指数生长期；在进行管形成测定之前，无血清饥饿处理12 h。根据实验设计加入无血清培养基稀释的0.5%的白蛋白溶液和无血清培养基作为对照组重悬细胞，计数，调整细胞浓度至4×105/mL。基质胶铺板：按照说明书要求在预冷的96孔板中每孔加入50 mL基质胶。旋转板直到凝胶均匀分布在整个孔上。避免气泡，在置于培养箱中在水平表面上聚合1小时。接种、管形成、拍照：将100  μL的HUVEC细胞(2×105/mL)悬浮液(1∶1加1%白蛋白溶液稀释)充分混匀后种于铺有基质胶的96孔板标记孔中。将板在37 ℃，5%CO2孵育4～6 h(Tubes将在2～4 h内开始形成)倒置显微镜拍照。

4 统计学分析

采用GraphPad Prism 9进行统计学分析及图像处理。数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析(Oneway Anova)，事后比较采用Bonferroni校正，两组间比较采用非配对双尾t检验(two-tailed T test)，P<0.05表示差异有统计学意义。

二、结果

1 不同来源HSA对HUVEC细胞增殖的影响

HUVEC细胞增殖活性检测结果显示，对比单纯无血清对照组，所有HSA(0.5%)处理组中，除酵母表达来源rHSA1处理组HUVEC细胞增殖活性无改变外(P=0.49，q=1.601)，其它HSA处理组均显示出显著促进HUVEC细胞增殖的活性(图1A)，且不同来源HSA处理组间的HUVEC增殖活性存在显著差异(P<0.001，F=10.84)(图1B)。

图1不同来源HSA(0.5%)处理48 h对HUVEC细胞增殖活性的影响

A：对比无血清对照组各HSA处理组HUVEC细胞增殖活性差异。B：不同来源HSA处理组HUVEC细胞增殖活性差异。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。图中所示细胞增殖活性%结果均以表示，n=4。

2 不同来源HSA对HUVEC细胞凋亡的影响

HUVEC细胞凋亡检测结果显示，对比无血清对照组，各HSA处理组凋亡细胞和坏死细胞(包括早期凋亡和晚期凋亡)比例均显著低于无血清对照组(P<0.001)，所有HSA处理组均显示出抑制HUVEC细胞凋亡的作用。同时各HSA样本组活细胞比例均显著高于无血清对照组(P<0.001)，所有HSA处理组均能显著增强HUVEC细胞活性(图2C)。进一步对不同来源HSA处理组HUVEC细胞各比例分析比较发现，不同处理组间活细胞(P=0.07，F=2.415)、凋亡细胞(P=0.2，F=1.624)和坏死细胞(P=0.28，F=1.376)比例均无统计学差异。

3 不同来源HSA对HUVEC细胞周期的影响

HUVEC细胞周期检测结果显示，对比无血清对照组，在HSA处理组中除pHSA2和pHSA6处理组G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.001)、S期无明显变化、G2/M期细胞比例明显升高(P<0.01)外，其它HSA处理组各细胞周期比例均无明显改变(图3C)。进一步对不同来源HSA处理组HUVEC细胞各周期比例分析比较发现，不同处理组间G0/G1期细胞(P<0.001，F=12.25)和G2/M期细胞(P<0.001，F=6.817)比例存在显著差异，而S期细胞(P=0.1，F=2.135)比例无统计学差异。

4 不同来源HSA对HUVEC细胞迁移的影响

基于前面的研究发现，且限于多样本处理下HUVEC细胞划痕和成管实验结果同步记录的难度，最终选择了pHSA样本中的pHSA3/6与rHSA1/2共4个样本进行了HUVEC细胞划痕和后续成管实验，分别标记为pHSA(1)/(2)和rHSA(1)/(2)。细胞划痕实验结果显示，与无血清对照组相比，HSA处理组中pHSA(1)和pHSA(2)处理组经过12 h(P<0.001)、24 h(P<0.001)、36 h(P<0.001，P=0.002)后划痕愈合程度更高，差异具有统计学意义，而rHSA(1)和rHSA(2)处理组较无血清对照组无明显差异(图4B)；进一步分析各时间点不同处理组间的划痕愈合程度差异发现，不同来源HSA处理12 h(P<0.001，F=11.3)、24 h(P<0.001，F=11.26)和36 h(P=0.01，F=5.908)后，各组间划痕愈合程度均具有统计学差异。

5 不同来源HSA对HUVEC细胞管形成的影响

管形成实验结果显示，经过6 h后与无血清对照组相比，HSA处理组中pHSA(1)和pHSA(2)处理组的节点数量(P=0.001、P=0.005)、管状分支(P<0.001)、及网状结构(P<0.001)均显著增多，而rHSA(1)和rHSA(2)处理组较无血清对照组无统计学差异(图5B)；进一步分析不同处理组间的管形成差异发现，不同来源HSA处理组的节点数量(P<0.001，F=15.9)、管状分支(P<0.001，F=20.36)、及网状结构(P<0.001，F=45.25)均具有统计学差异。

图2不同来源HSA(0.5%)处理48 h对HUVEC细胞凋亡的影响

A：不同来源HSA处理组HUVEC细胞凋亡情况流式细胞图；1-6表示pHSA1-6，7-8表示rHSA1-2。B：无血清对照组HUVEC细胞凋亡情况流式细胞图。每个图左下角Q4为活细胞(Annexin V-/PI-)，右下角Q3为早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)，右上角Q2为晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+)，左上角Q1为坏死细胞(Annexin V-/PI+)。C：对比无血清对照组各HSA处理组HUVEC细胞凋亡情况差异。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。图中所示细胞比例%结果均以表示，n=3。

三、讨论

图3不同来源HSA(0.5%)处理48 h对HUVEC细胞周期的影响

图4不同来源HSA(0.5%)处理对HUVEC细胞划痕愈合的影响

新生血管形成是一个重要的生物学过程，这对于维持人体正常生理功能和组织修复十分关键。内皮细胞在血管生成中扮演着重要角色，其增殖、凋亡和迁移对新生血管形成至关重要[14-15]。同时由于VEC位于循环血液和半实体组织之间的关键界面，并且不断暴露于各种循环因子、代谢产物和血浆物质的刺激中，使之容易受到损伤[16]。有研究发现血管内皮表层存在多糖-蛋白质复合物，也被称为血管内皮糖萼，其与循环血浆之间处于平衡状态，且被认为是血管内皮表面的天然保护屏障[17]。血浆中HSA分子的精氨酸及赖氨酸残基所携带的正电荷能够与多糖蛋白质复合物上的负电荷基团通过静电吸引相结合[18]。目前已有研究证明HSA有助于维护血管内皮屏障中血管内皮糖萼结构的稳定和完整性[19]，这对于血管内皮功能的维持具有重要意义。HSA作为人体血液循环中含量最高的血浆蛋白，也是与血管内皮直接接触最多的血浆蛋白；因此研究HSA对VEC的关键生物学效应的直接影响作用，有助于深入理解HSA对新生血管形成及血管内皮功能维持的调控机制，并为HSA未来的临床治疗应用提供新的思路和理论依据。

图5不同来源HSA(0.5%)处理6 h对HUVEC细胞管形成的影响

HSA具备的多种生物学功能使其通常作为传统血清的替代品用于细胞培养，它是真核细胞生长和存活所必需的生物活性成分的重要转运蛋白[20]。VEC增殖是新生血管形成的一个关键过程，VEC的增殖受多种因素调控，包括生长因子、细胞因子、炎症因子等，这些因子可以通过不同的信号途径促进或抑制内皮细胞的增殖过程。早在2004年的一项研究曾发现白蛋白对EC生长有明显促进作用[21]。但后续没有更多的研究表明HSA直接促进或抑制VEC的增殖。我们通过与单纯无血清对照组比较发现，除酵母来源的rHSA处理组为表现出明显的促进HUVEC细胞增殖作用外，其它HSA均显示出了显著的促进HUVEC细胞增殖的活性。并且我们的实验结果还显示，不同来源HSA间对HUVEC细胞增殖的影响存在差异，值得注意的是水稻来源rHSA也显示出较强的促进增殖的作用(rHSA2 vspHSA4，图1)。这说明不同来源HSA对HUVEC细胞增殖的影响可能与其成分差异有关，其中白蛋白本身翻译后修饰的影响是不容忽视的，因为rHSA制品中并不存在人源的非白蛋白成分。2003年国内的一项研究发现HSA的糖基化终产物具有抑制VEC的增殖的作用，并以剂量和时间依赖的方式诱导细胞凋亡[22]。2019年的一项研究也证明BSA的糖基化终产物抑制了HUVEC的细胞增殖[23]。

我们的研究结果显示所有的HSA处理组均显示出了显著抑制HUVEC细胞凋亡的作用，这再次印证了ZOELLNER等的研究结论[24]，并且他们认为白蛋白的抗凋亡活性机制，一方面与内皮细胞上存在介导抗凋亡作用的低亲和力白蛋白受体有关，另一方面白蛋白降低细胞内钙水平可能是白蛋白抑制内皮细胞凋亡途径的一部分，因为细胞内钙的升高与细胞凋亡的始动环节有关。后续他们的研究还发现白蛋白同样能够抑制组织外植体微VEC凋亡，并且他们再次得出结论血清白蛋白是人内皮细胞凋亡的特异性抑制剂。2008年Martin Schiller等的研究提出HSA结合的生物活性脂质具有抑制培养细胞的凋亡的作用，因为在脱脂处理后的HSA中并未显示出同样的抑制作用。但我们与H ZOELLNER等之前的两项研究都一致发现rHSA处理组显示出了与pHSA处理组同样的抑制效果，这也再次说明抑制细胞凋亡的作用主要与HSA分子本身有关，至少对于HUVEC细胞是如此；因为rHSA制品中并不含有那些包括生物活性脂质在内的人源非白蛋白成分。至于HSA抑制VEC凋亡的具体机制仍不明确，后续有研究发现增加HSA浓度可减少细胞凋亡并改善人类胰岛的功能[25]，这也再次印证了H ZOELLNER等之前提出白蛋白的抗凋亡活性是由细胞上的低亲和力白蛋白受体介导的观点。2012年LIU等的研究发现白蛋白能够通过阻止NOX/ROS介导的线粒体信号传导从而抑制细胞凋亡[26]。非常有意思的是，2010年的一项研究发现亚硝基化人血清白蛋白(SNO-HSA)具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[27]。这也再次说明HSA所展示出来的抑制或促进细胞凋亡的作用与HSA分子本身结构状态有关，如翻译后修饰的改变等。

我们的研究还发现与无血清对照组相比，pHSA2和pHSA6处理组出现了G0/G1期细胞比例显著降低，G2/M期细胞比例显著升高，这说明pHSA2和pHSA6处理促进了DNA的复制及有丝分裂进程，HUVEC细胞周期发生了改变。但这种影响在不同来源HSA处理组间存在差异，且与对照组相比rHSA处理对HUVEC细胞周期无影响，因此不同来源HSA对HUVEC细胞周期的影响可能与HSA制品中白蛋白及非白蛋白成分差异有关。2020年的一项研究发现白蛋白促进了G1期停滞的无血清培养肝癌细胞的增殖[28]。2021年的另一项研究发现牛血清白蛋白处理促进了细胞的有丝分裂进程，并且牛血清白蛋白并不是作为游离氨基酸的来源进行补偿，因为培养基中本身存在大量氨基酸，额外增加外源性氨基酸并不会影响DNA合成，因此研究者认为血清中白蛋白的存在可能向细胞传递了更广泛和多样可供选择的氨基酸信号[29]。关于HSA处理对HUVEC细胞周期影响的机制探究，我们认为可以从不同来源HSA制品间的成分差异进行分析和寻找联系。

VEC迁移对于血管生成至关重要，这一过程受趋化、粘附和机械刺激三个方面的调控[30]。通常，内皮细胞的趋化作用受到诸如血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等生长因子驱动，而粘附作用则与内皮细胞迁移增加相关，这是对整合素与细胞外基质成分结合后激活的反应。由于其位于血管内壁，内皮细胞不断受到剪切力的影响，这有助于激活迁移途径。目前尚无相关研究报道HSA对于VEC迁移和血管生成的直接影响。我们的研究发现，相较于无血清对照组，pHSA处理具有明显的促进HUVEC细胞迁移和血管形成的活性，而rHSA处理组则无统计学改变。我们认为造成这一差异的重要原因可能与pHSA和rHSA之间的非白蛋白成分差异有关。已知蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一种细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶，据报道在血管生成及相关过程中起着关键作用。PKC的激活在受到FGF和VEGF刺激后的EC增殖、以及在受到凝血酶刺激后的血管生成中都是必需的[31]。还有研究发现转铁蛋白(TRF)具有促进内皮细胞迁移和软骨新生血管形成的作用[32]。上述参与内皮细胞增殖、迁移及血管生成的关键分子均为人血浆来源蛋白，而原料来源是pHSA和rHSA的最主要差异。同时HSA作为血液中1-磷酸鞘氨醇(S1P)的主要载体分子之一，对于S1P的结合和运载十分重要，S1P通过转运蛋白从内皮细胞和红细胞释放后，由载体蛋白结合运载并在血液和淋巴液中循环，通过刺激靶细胞表面的特异性S1P受体(S1PR1–5)发挥生理功能[33-34]。有研究发现S1P能够通过S1PR1和S1PR3刺激内皮细胞(ECs)的增殖、存活、迁移并促进血管生成[35]。而血浆来源的S1P在rHSA制品中可能并不存在，因此我们认为S1P成分差异是pHSA和rHSA对于HUVEC迁移和血管生成作用差异的另一重要因素。

在本研究中，我们通过对体外无血清培养的HUVEC细胞添加HSA处理后，发现不同来源HSA对于VEC增殖、周期、迁移和血管生成的影响具有明显差异。包括rHSA在内所有的HSA处理均显示出了明显的抑制VEC凋亡的作用，且这种抑制作用在不同来源HSA之间并无明显差异。这提示我们HSA本身具有抑制VEC凋亡的作用。至于进一步明确不同来源HSA对于VEC相关生物学效应的影响机制研究，或许可以从不同来源HSA制品的成分异质性分析中寻找到突破口。

参考文献:

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基金资助:中国医学科学院血液安全保障及新产品新技术研究(No.2021-I2M-1-060)项目资助;

文章来源:刘卿,王宗奎,徐俊,等.不同来源人血清白蛋白对血管内皮细胞生物学效应的影响研究[J].临床输血与检验,2024,26(05):577-587.