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柴胡皂苷D调控miR-34a对胶质瘤细胞C6增殖与自噬的影响

2024-01-29 33 上传者：管理员

摘要：目的:探讨柴胡皂苷D调控miR-34a对胶质瘤细胞C6增殖与自噬的影响。方法:分别以终浓度为0、3、6、9、12、15μmol/L的柴胡皂苷D作用胶质瘤细胞C6后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力；Western blot和RT-qPCR检测胶质瘤细胞C6中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin1表达情况。将胶质瘤细胞C6分成4组：对照组(Control组)、柴胡皂苷D组(Ssd组)、柴胡皂苷D+miR-34a阴性对照转染组(Ssd+miR-34a NC组)、柴胡皂苷D+miR-34a inhibitor转染组(Ssd+miR-34a inhibitor组),CCK-8法检测miR-34a NC和miR-34a inhibitor在柴胡皂苷D处理后对胶质瘤细胞C6增殖能力的影响；Western blot检测各组胶质瘤细胞C6中自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况。结果:经过不同浓度的柴胡皂苷D处理48 h后，胶质瘤细胞C6增殖能力明显下降，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达水平均升高(P<0.05);胶质瘤细胞C6中miR-34a表达水平升高(P<0.05)。转染后，Ssd组胶质瘤细胞C6增殖率、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达水平与Ssd+miR-34a NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05);Ssd组、Ssd+miR-34a NC组胶质瘤细胞C6增殖率低于Control组和Ssd+miR-34a inhibitor组，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达水平均高于Control组和Ssd+miR-34a inhibitor组，差异均有统计学意义(P<0.05);Ssd+miR-34a inhibitor组胶质瘤细胞C6增殖率低于Control组，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于Control组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:柴胡皂苷D可能是通过调控miR-34a来抑制胶质瘤细胞C6增殖和诱导自噬发生。

关键词：
miR-34a
化疗
柴胡皂苷D
胶质瘤
自噬
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胶质瘤起源于神经胶质细胞，是颅内最为常见的原发性恶性肿瘤，调查[1]显示，胶质瘤发病率达到3.69/10万。目前临床上对于胶质瘤的治疗以手术、化疗为主，但多数患者临床疗效仍然较差，5年总生存率不超过35%[2]。故寻找新的有效治疗靶点和方案，对改善患者预后尤为重要。近年来，中医药在临床肿瘤治疗获得了一定成果，柴胡作为常用中药之一，其化学活性成份也受到明显关注。柴胡皂苷类是柴胡最具代表性的化学活性成分，含有多种单体，其中柴胡皂苷D药理活性最强，在抗肿瘤方面存在明显生物活性[3]。以往研究[4]显示，柴胡皂苷D可以抑制胶质瘤细胞体内外移植瘤生长、迁移和侵袭。但关于柴胡皂苷D调控胶质瘤细胞C6的具体机制尚处于探索中。miR-34a属于肿瘤抑制基因，能够调控多种因子表达继而影响肿瘤增殖、凋亡等[5]。有研究[6]显示，miR-34a可以抑制脑胶质瘤侵袭、转移。基于此，本研究拟进行细胞实验，观察柴胡皂苷D能否抑制胶质瘤细胞C6增殖和诱导其自噬，并验证柴胡皂苷D是否可通过调控miR-34a来影响胶质瘤细胞C6生物学行为。

1、材料与方法

1.1 主要材料

胶质瘤细胞C6（南京凯基生物科技发展有限公司），柴胡皂苷D（四川维克奇生物科技有限公司），7300全自动荧光定量PCR仪及实时荧光定量PCR试剂盒（美国ABI公司），总RNA提取Trizol试剂及Lipofectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen公司），放射沉淀免疫试验（RIPA）裂解液（北京索莱宝科技有限公司），二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司），TBST液、Western印迹转膜缓冲液、Western印迹一抗稀释液及Western印迹二抗稀释液（上海雅酶生物医药科技有限公司），凝胶电泳仪（美国Bio-Rad公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），总蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），辣根过氧化酶标记的兔抗鼠酶标二抗IgG（北京博奥生物技术有限公司），CCK-8试剂（上海尚宝生物科技有限公司），miR-34a及U6引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

DMEM培养基中加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素对胶质瘤细胞C6培养，培养箱环境：温度37℃，5%CO2。当细胞融合至70%～80%时，将其分为6组，分别予以终浓度为0、3、6、9、12、15μmol/L的柴胡皂苷D处理48 h。

1.2.2 CCK-8实验

在96孔板中进行胶质瘤细胞C6接种，浓度为每孔6×103个细胞，之后在培养箱中孵育24 h，再加入CCK-8溶液10μL/每孔，继续孵育2 h，去上清，加入DMSO 150μL/孔，低速振荡5 min，通过酶标检测仪检测波长在450 nm处吸光度（OD值），计算不同浓度柴胡皂苷D处理下胶质瘤细胞C6的增殖率。每组设置6个复孔，独立重复实验3次。

1.2.3 蛋白免疫印迹法（Western blot)

各组胶质瘤细胞C6中加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min,3 000 r/min离心，提取细胞总蛋白。BCA法检测蛋白浓度，加入一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗在37℃水溶箱中孵育1 h后，TBST液洗涤5 min×3次，加入显色液，通过凝胶成像系统检测蛋白条带表达情况，内参半定量分析胶质瘤细胞C6中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR)

采用Trizol试剂提取各组胶质瘤细胞C6总RNA，将RNA逆转录为cDNA，行荧光定量PCR扩增，反应体系为10μL，样品管和内参（U6）管均设复管。预变性：95℃30 s，循环1次；反应条件：95℃1 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃30 s，循环40次。反应结束后，根据仪器自带软件分析荧光信号，获取Ct值。采用2-△△CT法计算胶质瘤细胞C6中miR-34a mRNA表达水平。miR-34a上游引物：5′-ACACTC-CAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.2.5 细胞转染

当胶质瘤细胞C6融合至70%～80%时，在6孔板中铺6×105个细胞，将细胞分成4组：对照组（Control组）、柴胡皂苷D组（Ssd组）、柴胡皂苷D+miR-34a阴性对照转染组（Ssd+miR-34a NC组）、miR-34a inhibitor转染+柴胡皂苷D组（Ssd+miR-34a inhibitor组）。对照组不予任何处理；Ssd组使用9μmol/L柴胡皂苷D处理48 h；将miR-34a inhibitor、miR-34a NC分别转染至胶质瘤细胞C6，室温下静置20 min，分别加入到培养孔中，再继续孵育4 h。miR-34a inhibitor+Ssd组、Ssd+miR-34a NC组转染后，进行培养基更换，再用9μmol/L柴胡皂苷D处理48 h。转染操作均按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行，并检测各组胶质瘤细胞C6中miR-34基因表达情况和自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料采用表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响

3、6、9、12、15μmol/L组的柴胡皂苷D处理后的胶质瘤细胞C6增殖率均低于0μmol/L组（P<0.05);Beclin1表达水平均高于0μmol/L组（P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于0μmol/L组（P<0.05）。见表1。

表1 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响

2.2 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6 miR-34a表达的影响

3、6、9、12、15μmol/L组的柴胡皂苷D处理后的胶质瘤细胞C6 miR-34a表达水平均高于0μmol/L组（P<0.05）。见表2。

表2 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6miR-34a表达的影响

2.3 miR-34a转染对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响

Ssd组、Ssd+miR-34a NC组、Ssd+miR-34a inhibitor组胶质瘤细胞C6增殖率均低于Control组；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1表达水平均高于Control组（P<0.05),Ssd组、Ssd+miR-34a NC组胶质瘤细胞C6增殖率均低于Ssd+miR-34a inhibitor组；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1表达水平均高于Ssd+miR-34a inhibitor组（P<0.05）。见图1-图2及表3。

图1 各组胶质瘤细胞C6增殖率比较

图2 四组胶质瘤细胞C6自噬相关蛋白表达比较

表3 各组胶质瘤细胞C6自噬相关蛋白灰度值比较

3、讨论

胶质瘤恶性程度高，具有侵袭性强、治愈率低、复发率高等特点，发病率及致死率在中枢神经系统肿瘤中均处于第一位，对人类健康威胁大。随着中医药学的发展和在临床上的推广，通过中药来预防和治疗肿瘤也越发受到重视，探讨中医药在抗肿瘤方面的作用机制已成为医学研究热点。

柴胡皂苷是柴胡主要活性成分，其中柴胡皂苷D活性最显著。近年来研究[7]发现，柴胡皂苷D具有多种药理作用，包括保肝、抗肿瘤、抗癫痫等。时薛丽等[8]研究显示，柴胡皂苷D可以抑制胃癌细胞生长和迁移。党锋等[9]研究认为，柴胡皂苷D可通过诱导结直肠癌细胞自噬来抑制癌细胞增殖。自噬是一种分解代谢过程，细胞自噬与其衰老、凋亡均为非常重要的生物学现象，在生物生长和发育中起到了重要作用。报道指出，细胞自噬异常与恶性肿瘤发生和发展存在密切关联[10,11,12]。细胞自噬会受到自噬相关基因以及多种信号通路的调控，细胞收到相关信号或经过刺激后，能够启动III型磷脂酰肌醇激酶（VPS34）与Beclin1结合，形成吞噬泡后和自噬相关因子进行组装对接并形成自噬小体，待其成熟后再与溶酶体进行结合，最终降解细胞内物质，起到自噬作用。Beclin1可以调控自噬体膜合成，继而调控细胞自噬，故而Beclin1蛋白表达水平也能在一定程度上显示细胞自噬情况[13]。功能延伸为细胞自噬过程的重要环节，在功能延伸阶段，LC3-Ⅰ可转化为LC3-Ⅱ并存在于自噬体膜上，在各类自噬接头中起到重要作用，故而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以反映细胞自噬情况[14]。以往关于柴胡皂苷D与癌细胞自噬的研究[9]显示，柴胡皂苷D会影响人结直肠癌细胞SW480中LC3相关蛋白水平，自噬抑制剂3-MA，可以对柴胡皂苷D诱导的结直肠癌细胞自噬进行负向调控。本研究探讨柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6增殖和自噬的影响，结果显示，经柴胡皂苷D处理48 h后，胶质瘤细胞C6增殖率明显受到抑制，且随着柴胡皂苷D浓度增加，增殖率逐渐下降，在浓度为9μmol/L时增殖受限最为显著，故而选择将9μmol/L作为后期工作浓度。自噬结果显示，经柴胡皂苷D处理后，自噬相关蛋白Beclin1表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显升高，提示柴胡皂苷D可以诱导胶质瘤细胞自噬，抑制其增殖。

目前有关柴胡皂苷D是通过何种途径影响胶质瘤细胞自噬的研究报道很少。有研究[15]发现，经小柴胡汤处理过的神经胶质细胞瘤中miR-34a表达水平随着小柴胡汤作用时间延长而升高。miR-34a是miR-34家族成员，可以调控多种靶基因（如抑癌基因p53）表达和信号通路（如Wnt、TGF-β/Smad3/4信号通路）活性，继而影响肿瘤细胞生物学行为[16]。过去研究[17]显示，miR-34a能够调控TGF-β/Smad4信号通路而促使细胞自噬发生，继而降低结肠癌细胞耐药性。在视网膜母细胞瘤和骨肉瘤的研究中也发现，miR-34a能够促进癌细胞自噬发生[18,19]。这些研究结果提示，miR-34a与癌细胞自噬关系密切，其表达水平升高促进癌细胞自噬发生。本次研究分析miR-34a转染对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响，结果发现与Control组相比，Ssd组、Ssd+miR-34a NC组和Ssd+miR-34a inhibitor组胶质瘤细胞C6增殖率均明显下降，而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显升高，且与Ssd+miR-34a inhibitor组相比，Ssd组、Ssd+miR-34a NC组对肿瘤增殖的抑制作用更为显著，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达水平更高，提示提示柴胡皂苷D可能是通过调控miR-34a实现来诱导胶质瘤细胞C6自噬。

综上，胶质瘤细胞C6实验从细胞水平验证了柴胡皂苷D可以抑制胶质瘤细胞C6增殖和诱导自噬发生，这种作用机制可能是通过调控miR-34a实现的。

参考文献:

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