三叉神经痛是一种神经系统疾病，好发于中老年人，女性患病率高于男性[1]。主要症状为头面部广泛剧烈性疼痛，多发生于三叉神经一个或多个分支处。三叉神经痛分为原发性三叉神经痛和继发性三叉神经痛。原发性三叉神经痛尚未呈现出明显的神经系统体征，起病时检查表明无器质性及功能性病变[2]，其发生率约为0.052 2%[3]。原发性三叉神经痛大鼠与正常大鼠相比：三叉神经节中降钙素基因相关肽（CGRP）及其受体表达升高，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及其磷酸化、炎性反应增强等[4,5]。

目前治疗原发性三叉神经痛主要以药物为主，抗癫痫药物卡马西平为其首选，初始有效率可达80%[6]。但长期服用该药物存在头晕、皮疹、共济失调等不良反应，且具有快速耐受性[7]。采用手术方法治疗原发性三叉神经痛具有一定的疗效，但该方法一定程度上无法改善某些患者疼痛程度，还可能发生复视、听力减弱、浆液性脑膜炎等并发症[8]。且2种方法治疗原发性三叉神经痛仍有超过50%的患者存在疼痛复发的现象[9]。复方中药在治疗原发性三叉神经痛方面表现出较好的疗效，具有更高的安全性和更低的复发率，存在良好的应用价值。复方藜芍片由白芍、蒺藜、葛根、钩藤、生丹参、珍珠母、白芷、白菊花、蔓荆子、薄荷10味中药联合制成，具有活血化瘀、镇痛镇静等功效[10]。本研究探讨复方藜芍片对大鼠原发性三叉神经痛的治疗作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60只SPF级SD大鼠，雄性，体重（200±20)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证编号：SCXK（湘）2019-0004。常规饲养，自由进食和饮水，每日12 h交替照明，饲养温度为22～25℃，相对湿度50%～70%。实验前适应性饲养7 d。本研究所有操作和步骤均通过长沙医学院医学伦理委员会审核（批件号IACUC-20220309-02）。

1.1.2 主要仪器和试剂

实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；Von Frey疼痛测试棒（美国Dan Mic Global公司）；PCR仪（北京东林昌盛生物科技有限公司）；Bio Tek酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。卡马西平片（批号H11O22279，诺华制药）；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA Kit（批号KE10002）、大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA Kit（批号KE00021）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号P0012，上海碧云天生物技术有限公司）；CGRP Rabbit p Ab（批号A5542，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；PVDF膜（批号IPVH00010，德国Merck Millipore公司）；磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶抗体（批号AF00879，湖南艾方生物科技有限公司）；HRP-conjugated山羊抗小鼠Ig G（批号GB23302）、HRP-conjugated山羊抗兔Ig G（批号GB23303）、山羊抗小鼠二抗（批号G1214-100UL）均购自Servicebio。

1.2 方法

1.2.1 药物制备

复方藜芍片由10味中药组成，将其熬制、合并提取液，并浓缩后得85 m L水提液（含药材143 g,1 680 mg/m L），每100克体质量大鼠ig给药1 m L。中剂量组在此基础上稀释2倍即840mg/kg，低剂量组依次稀释即420 mg/kg[10]。

1.2.2 建模方法

术前禁食8 h，采用ip 0.4%戊巴比妥钠（1 m L/100 g）麻醉大鼠。备皮消毒，沿右侧触须垫部上缘处行约1 cm切口，分离筋膜、神经，于眶下神经处轻微结扎2次，每次相隔约2 mm[11]。待大鼠苏醒并在安静环境中稳定30 min后，刺激术侧触须垫，大鼠出现躲避、攻击、搔抓面部等阳性反应1项或多项时的最小刺激值即机械痛敏阈值（MWT），若MWT显著低于术前则可认定造模成功[12]。

1.2.3 分组及给药

60只原发性三叉神经痛大鼠随机分为5组，各组12只。模型组ig同等剂量生理盐水；卡马西平组根据大鼠体质量ig 20 mg/kg的0.1 m L/kg卡马西平溶液；复方藜芍片低、中、高剂量组分别按照体质量ig 420、840、1 680 mg/kg复方藜芍片溶液，每日1次，持续给药28 d。

1.2.4 MWT

使用Von Frey毛刷在建模前1 d、当天及术后每天规定时间内刺激大鼠术侧胡须垫区，从最低的刺激力（0.008 g）开始逐渐增大，每个刺激力以30～60 s的间隔重复检测6次，直至大鼠出现1项或多项阳性反应，则认为该刺激实验为阳性，即该阈值为有效刺激阈值。此时出现阳性反应的最小刺激力为术侧面部MWT[12]。

1.2.5 ELISA检测血清中TNF-α和IL-1β炎性因子水平

术后第29天麻醉，各组大鼠于腹主动脉处采血，3 000 r/min离心15 min，抽取上层血清；按照试剂盒说明书的操作顺序，进行各个孔吸光度（A）值的测定。

1.2.6 q-PCR检测三叉神经节中TNF-α和IL-1βm RNA表达水平变化

术后第29天，每组随机抽取6只大鼠麻醉，取出术侧三叉神经节；在研磨组织样本中加入Trizol提取总RNA；使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为c DNA；采用实时荧光定量PCR仪，获得溶解曲线，并利用溶解曲线计算出扩增的特异性，基于Ct值，对照GAPDH引物序列，运用2-ΔΔCt方法得出大鼠三叉神经节中TNF-α和IL-1βm RNA表达水平。引物由上海吉凯基因医学科技股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.7 Western blotting检测三叉神经节中CGRP表达

术后第29天，麻醉每组剩余的6只大鼠（q-PCR每组随机抽取6只大鼠后），取出术侧三叉神经节，于液氮内冷冻；称重后将其放入匀浆器中，随后加入含有PMSF的裂解液，以获得其中的蛋白；注入5×Loading buffer，置于沸水中煮10 min，放置于-80℃冰箱内；采用SDS-PAGE电泳技术，使蛋白从凝胶基质转移至合成膜支持物上，并与PVDF膜相结合，形成印迹；将PVDF膜放入含有TBST的抗体孵育盒中，4℃过夜，弃去液体；加入TBST适当稀释的一抗（1∶1 000),4℃过夜，弃去液体；加入TBST稀释的二抗（1∶2 000），室温孵育60 min。ECL曝光成像，采用Image J对图像进行灰度分析并计算出CGRP蛋白相对表达水平。  

表1 引物序列  

1.2.8 免疫组化检测大脑纹状体中p-p38 MAPK水平

术后第29天麻醉，取术侧大脑纹状体组织于4%多聚甲醛中；使用PBS缓冲液清洗组织，放入固定液中浸泡；取出组织并依次放入不同浓度的乙醇中脱水、二甲苯溶液中透明，石蜡包埋制成切片；将切片浸入p H 6.0的柠檬酸盐缓冲液中，微波炉抗原修复8 min；切片放入0.01 mol/L PBS溶液中晃动洗涤3 min×3；切片浸入3%H2O2×10 min中阻断内源性过氧化物酶；滴加5%羊血清，37℃封闭20min；切片上滴入适当稀释的一抗（1∶100），置于湿盒内，4℃冰箱过夜；滴加二抗，置于温箱中30min；使用DAB进行显色，室温孵育5 min；浸于苏木素溶液中复染3 min,PBS返蓝。脱水透明，中性树胶封片、显微镜下观察。使用Image J软件对切片图像进行累计光密度（IOD）分析。

1.3 统计学方法

用SPSS 26.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2、结果

2.1 MWT变化

术后当天各组大鼠术侧MWT与术前相比均显著下降（P<0.05），大鼠原发性三叉神经痛模型造模成功。与模型组相比，给药后第3天开始，卡马西平组MWT显著增加（P<0.05、0.01），并持续至给药终期，第28天卡马西平组MWT值为14.17；给药后第9～11天开始，复方藜芍片中、高剂量组MWT均明显上升（P<0.05）；与卡马西平组相比，给药第17～19天开始，复方藜芍片中、高剂量组MWT均显著上升（P<0.05），见图1。

2.2 血清中TNF-α和IL-1β水平变化

与模型组相比，卡马西平组、复方藜芍片中、高剂量组血清中TNF-α、IL-1β水平明显下降（P<0.01），见图2。

图1 各组大鼠术侧面部MWT变化  

图2 血清中TNF-α和IL-1β水平变化   

2.3 三叉神经节中TNF-α和IL-1β m RNA表达水平变化

如图3所示，与模型组相比，卡马西平组、复方藜芍片中、高剂量组三叉神经节中TNF-α和IL-1βm RNA表达水平显著性降低（P<0.01）。

2.4 三叉神经节中CGRP表达变化

与模型组相比，卡马西平组和复方藜芍片各组三叉神经节CGRP表达均明显降低（P<0.01），见图4。

2.5 大脑纹状体中p-p38 MAPK表达变化

如图5所示，大脑纹状体细胞胞浆和细胞核中，p-p38 MAPK阳性表达为黄色或棕黄色染色。如图6所示，模型组阳性染色显著，p-p38 MAPK抗体明显表达；与模型组相比，复方藜芍片中、高剂量组p-p38 MAPK表达显著性下降（P<0.01）。

图3 术侧三叉神经节中TNF-α和IL-1β m RNA的表达   

图4 术侧三叉神经节中CGRP的表达   

3、讨论

三叉神经痛是最常见的脑神经疾病，疼痛发作具有区域性、单侧性、剧烈性、频率高度特异性以及间歇性等特点，其间隔从几秒至几年不等，但随着时间的推移将逐渐缩短[13]。复方藜芍片由10味中药联合组成，诸药配合具有活血化瘀、镇痛镇静、平肝潜阳、解痉的作用。复方藜芍片在临床中应用多年，能有效减轻偏头痛的疼痛程度和发作频率，且高达79.7%的有效率和较低的不良反应率[14]，彰显了复方藜芍片较好的治疗效果。

图5 纹状体中p-p38MAPK表达（×40)   

图6 纹状体中p-p38 MAPK表达  

原发性三叉神经痛具体的发病机制尚不完全明确。病理生理学假说认为，原发性三叉神经痛是由于脑干附近的三叉神经感觉根被血管近端压迫所导致。神经根的进入区被认为是易发生脱髓鞘的脆弱区域，而血管压迫可能启动局灶性脱髓鞘和再髓鞘化过程[15,16]。临床研究表明，原发性三叉神经痛与症状侧神经受血管压迫并伴有形态学改变存在一定的关联性，而在无症状侧少见[17]。故本实验采用慢性压迫性损伤眶下神经法建立大鼠原发性三叉神经痛模型，模拟临床三叉神经受压迫而引起痛觉超敏的表现，并定时测定术侧大鼠MWT。研究发现：建模前1 d，各组大鼠MWT处于较高水平且无统计学差异。模型组随着时间的延长，大鼠面部疼痛加剧，导致机械痛阈急剧下降。而建模后第3天开始，卡马西平组大鼠MWT与模型组相比显著性上升。复方藜芍片中、高剂量治疗后，大鼠的MWT升高，说明复方藜芍片中、高剂量可以改善大鼠原发性三叉神经痛病理症状。

张学智等[18]研究发现，三叉神经痛患者部分髓鞘受压迫后变薄，并在三叉神经病变中产生炎症反应，进而引起炎症细胞浸润等。炎性细胞大量聚集于神经组织以及炎症因子过度表达，可影响神经病理性疼痛的疼痛程度[19]。TNF-α是炎症反应的起始因子，主要由巨噬细胞和淋巴细胞分泌，存在于中枢系统和周围神经系统中。TNF-α具有极强的炎症作用，可通过促进Th1细胞释放IL-1β、IL-6等促炎因子，抑制IL-10等抗炎因子的释放，加剧神经组织的敏感性，并激活炎症细胞，参与神经性疼痛的发生发展，导致患者出现疼痛难忍和痛觉过敏的现象[20,21]。IL-1β是一种强效的促炎细胞因子，主要由单核-巨噬细胞分泌，也可通过自分泌和旁分泌的方式促进自身的释放。IL-1β可促进5-羟色胺、P物质等释放，与致痛物质共同作用，使得疼痛长期存在[22]。大量炎症介质的释放会触发并维持中枢敏化，提升兴奋性神经递质的释放和降低抑制性突触传递，产生痛觉过敏，并进一步促进外周敏化[23]。本研究结果发现，与卡马西平组相比，模型组大鼠血清和三叉神经节中TNF-α、IL-1β表达显著性上升，提示炎症因子在原发性三叉神经痛的发生发展中发挥重要作用。复方藜芍片中、高剂量治疗后大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平以及三叉神经节中TNF-α、IL-1β m RNA相对表达量显著降低，提示复方藜芍片可通过抑制过度表达的炎症因子，对原发性三叉神经痛大鼠产生镇痛作用。

三叉神经末梢中含有多种免疫细胞，如巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞等，当受到致病因素刺激后，此类细胞通过大量分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子[24]，造成神经细胞炎性损伤，还能诱导脊髓后角释放致痛炎性介质CGRP等[25]，产生痛觉过敏。研究表明，三叉神经痛模型大鼠血清中CGRP浓度明显上升，说明CGRP与三叉神经痛密切相关[26]。CGRP是一种具有传递痛觉信息和强烈舒张血管的神经肽，其介导神经源性炎症并与相关炎症介质及细胞因子相互作用，参与神经病理性疼痛的发生[27]。研究表明，CGRP在向中枢神经系统传导痛觉和痛觉过敏的过程中发挥关键性作用[28]。CGRP通过诱导胶质细胞以及三叉神经细胞中P2X3、p38 MAPK等的表达水平，促使中枢神经系统过敏持续存在，起到伤害性递质的作用，同时通过促炎引起外周敏化，诱导疼痛产生[29]。本实验研究显示，通过复方藜芍片治疗后三叉神经节中CGRP表达含量显著降低，表明复方藜芍片可能通过下调三叉神经节中CGRP水平，达到降低痛觉传递和痛觉增敏的效果。

p38 MAPK为细胞内信号分子，主要分布于胞浆中，被应激因素如炎症因子、机械损伤等刺激激活后，转移至细胞核内，其通过诱导多种胞内反应参与神经性疼痛和其他慢性疼痛的发生发展[5]。当p38 MAPK信号通路被激活后，炎症因子的生成增多，p38 MAPK表达量显著上升并发生磷酸化生成p-p38 MAPK[30]，主要表达于细胞核、细胞质及纹状体中特有的斑片状结构。p-p38 MAPK过度表达在中枢神经系统中会导致炎症反应加重、神经细胞坏死、组织水肿等负性损伤。本实验研究显示，与模型组相比，复方藜芍片中、高剂量治疗后大鼠大脑组织纹状体中p-p38MAPK阳性表达显著性降低。

综上所述，复方藜芍片对原发性三叉神经痛具有一定的治疗效果，可显著提升MWT，减轻机体炎症反应，降低CGRP和p-p38MAPK表达水平，为临床上治疗原发性三叉神经痛提供科学参考和理论依据。

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基金资助:国家级大学生创新创业训练计划项目(202110823024);

文章来源:李顺欣,郭姝羽,陈宇翔等.复方藜芍片对大鼠原发性三叉神经痛的治疗作用[J].现代药物与临床,2024,39(03):563-569.