偏头痛是一种复发性神经血管疾病，由遗传、表观遗传和环境因素共同引起[1]。《2019年全球疾病负担》报告显示，偏头痛是328种疾病和危害中第六大常见疾病，也是导致残疾的第二大常见疾病[2]。其典型症状包括中度至重度搏动性疼痛，且可能伴有对光线、噪音和气味的异常敏感性[3]。目前，偏头痛的发病机制尚不明确，遗传易感性和三叉神经系统的激活被认为是偏头痛的主要病理生理因素[4]。临床通常使用非甾体类抗炎药(NSAID)治疗偏头痛，然而NSAID副作用较多，可增加胃肠道溃疡及心脏和肾脏疾病的风险[5,6]。A型肉毒杆菌毒素(BTX-A)是一种局部给药的神经毒素，可抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放，用于治疗以肌肉活动过度为特征的疾病[7,8]。据报道，它还可有效治疗偏头痛[9]。然而，目前尚不清楚BTX-A治疗偏头痛的具体分子机制。本研究使用硝酸甘油所致偏头痛大鼠模型为研究对象，观察不同剂量BTX-A对偏头痛大鼠行为学和炎症因子的影响，并进一步探讨BTX-A治疗偏头痛的可能分子机制。

1、材料与方法

1.1实验用材料和试剂

健康雄性SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号：SCXK(鲁) 2023-0002];硝酸甘油注射液购自北京益民药业有限公司；BTX-A购自兰州生物制品研究所有限责任公司；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、转印电泳仪均购自上海赛默飞世尔科技公司；抗降钙素基因相关蛋白(CGRP)/P物质样免疫反应物(SP-LI)多克隆抗体购自上海Sigma-Aldrich公司；亚历克萨荧光(Alexa Fluor) 488/594标记的山羊抗兔/鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗、抗GAPDH抗体、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、抗瞬时受体电位香草酸(TRPV)1抗体均购自美国Abcam公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Trition、BeyoImagerTM600化学发光成像系统、电化学发光(ECL)试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司；IX73型倒置荧光显微镜购自上海奥林巴斯公司。

1.2实验动物

健康雄性SD大鼠32只，7～8周龄，体质量210～250 g。饲养条件为光照/黑暗循环12 h,室温控制在(22±2)℃,湿度控制为45%～50%,所有大鼠可自由摄食饮水。本研究经佳木斯市中心医院动物伦理委员会批准。实验过程严格遵循美国国立卫生院倡导的实验动物关怀和使用指导原则及以减少、替代和优化为核心的动物实验3R原则。大鼠均适应性喂养1 w。

1.3偏头痛大鼠模型构建

根据既往文献作为参考[10],采用硝酸甘油额叶和颞叶皮下注射法制备偏头痛大鼠模型。研究开始的第1、3、5、7、9天，除对照组外，其余各组注射10 mg/kg硝酸甘油，每只大鼠共注射5次。模型成功标准：大鼠持续约30 min出现双耳发红、烦躁不安、爬笼次数增多、四肢频繁挠头等现象，活动减少、蜷卧，表明造模成功[7]。

1.4分组与给药

采用随机数字表法将大鼠随机分为对照组、模型组、5 U/kg BTX-A组和10 U/kg BTX-A组，每组各8只。对照组额叶和颞叶区域皮下注射0.9%氯化钠(NaCl);模型组造模成功2 h后额叶和颞叶区域皮下注射0.9% NaCl; 5 U/kg BTX-A组和10 U/kg BTX-A组在造模成功2 h后额叶和颞叶区域皮下注射5、10 U/kg BTX-A。

1.5观察指标与检测方法

1.5.1行为学测试

爬笼与挠头次数增加被认为是偏头痛的指标[11,12]。第9天注射结束后0～30 min、31～60 min、61～90 min、91～120 min对各组行为学进行测试。行为学测试由不知情的研究人员进行。用摄像机记录每组烦躁情况，录像记录挠头(包括单爪挠、双爪挠)和爬笼的次数。

1.5.2标本的获取

行为学测试结束后，采用断颈法处死各组大鼠，收集各组颈静脉血浆10 ml并置于-20℃备用；剥离三叉神经颈髓复合体置于-80℃中备用。

1.5.3定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组大鼠炎症因子和TRPV1表达

使用核糖核酸(RNA)提取试剂盒从各组颈静脉血浆和三叉神经节中提取总RNA,随后使用cDNA合成试剂盒将其逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参来评估肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和TRPV1的表达量。反应条件如下：95℃ 持续15 min; 94℃15 s、55℃30 s、72℃45 s, 40个循环；72℃延伸10 min[13]。引物序列如下：TNF-α:5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3′(正向);5′-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3′(反向);IL-6:5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3′(正向);5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′-3′(反向);iNOS:5′-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3′(正向);5′-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3′(反向)TRPV1:5′-CCGGCTTTTTGGGAAGGGT-3′(正向);5′-GAGACAGGTAGGTCCATCCAC-3′(反向);GAPDH:5′-CATGTGTAGCGGAGCAAGGTT-3′(正向),5′-TGATCCCAGGGAAGCTGAGT-3′(反向)。

1.5.4放射免疫分析法检测各组大鼠CGRP和SP-LI水平

三叉神经节样本在匀浆器中手动匀浆后6 322 r/min离心10 min。根据制造商的说明，将样品或标准品(Sigma)稀释在含有1∶120 000抗CGRP/SP-LI多克隆抗体(Sigma)和含有放射性碘化CGRP/SP-L1标准的示踪剂的缓冲液中。将稀释样品在4℃下孵育48 h。然后通过添加100μl蒸馏水(含10%活性炭、2%葡聚糖和0.2%脱脂奶粉)分离抗原结合和游离肽。将样品旋涡并以3 064 r/min离心20皿。用γ计数器测定含有游离肽的颗粒和含有抗体结合肽上清液的放射性水平。根据标准浓度曲线计算样品CGRP和SP-L1浓度[14]。

1.5.5免疫荧光染色检测各组TRPV1表达

使用冰冻切片机将石蜡样本切片，加入含0.3%曲拉通(Triton)的封闭液室温封闭1 h。封闭完成后加入抗TRPV1抗体于4℃孵育过夜。向切片上加入亚历克萨荧光(Alexa Fluor) 488/594标记的山羊抗兔/鼠IgG二抗(稀释比例为1∶1 000)。室温孵育1 h后用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察、拍片。用图像分析系统分析TRPV1荧光强度[15]。

1.5.6 Western印迹检测各组TRPV1的表达

取各组三叉神经颈髓复合体组织，经过充分匀浆裂解后，取其上清液，并使用BCA法测定该上清液的蛋白质浓度。随后，在95℃下进行加热变性处理，之后加入蛋白质样品进行电泳，以300 mA的恒流将蛋白质转移到PVDF膜上。在室温条件下，使用5%的脱脂牛奶对膜进行封闭处理，持续60 min。接着，分别加入抗TRPV1抗体(1∶2 000稀释)和抗GAPDH抗体(1∶1 000稀释),在4℃条件下孵育过夜。之后，用TBST洗涤5 min。随后，加入HRP标记的二抗(1∶3 000稀释),室温孵育1 h,再用Tris缓冲盐水吐温(TBST)洗涤5皿。最后，采用ECL进行显色，并通过凝胶成像系统对结果进行分析。GAPDH作为内参蛋白，目的蛋白的相对表达量通过计算目的蛋白与内参蛋白的比值来确定[16]。

1.6统计分析

使用GraphPad Prism8.0进行方差分析、LSD-t检验。

2、结 果

2.1 BTX-A对硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠行为的影响

在第9天注射BTX-A后0～30 min、31～60 min、61～90 min内，与对照组相比，模型组爬笼和挠头次数显著增多(P<0.05);与模型组相比，5 U/kg BTX-A和10 U/kg BTX-A组爬笼和挠头次数显著减少(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。BTX-A注射后91～120 min,各组爬笼和挠头次数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 BTX-A对硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠爬笼和挠头次数的影响

2.2 BTX-A对偏头痛大鼠颈静脉血浆和三叉神经节中炎症因子表达的影响

qRT-PCR检测结果显示(表2),与对照组相比，模型组颈静脉血浆和三叉神经节中TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表达显著较高(P<0.01);与模型组相比，5 U/kg BTX-A和10 U/kg BTX-A组TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表达显著较低(P<0.01)。

表2 BTX-A对偏头痛大鼠颈静脉血浆和三叉神经节中炎症因子表达的影响

2.3 BTX-A对偏头痛大鼠颈静脉血浆和三叉神经节中CGRP和SP-LI水平的影响

与对照组相比，模型组颈静脉血浆和三叉神经节中CGRP和SP-LI水平显著较高(P<0.05);与模型组相比，5 U/kg BTX-A和10 U/kg BTX-A组CGRP和SP-LI水平显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表3。

2.4 BTX-A对偏头痛大鼠模型中TRPV1表达的影响

与对照组相比，模型组TRPV1表达显著较高，5 U/kg BTX-A和10 U/kg BTX-A可显著降低模型组TRPV1表达(P<0.05)。见表3。

表3 BTX-A对偏头痛大鼠颈静脉血浆和三叉神经节中CGRP和SP-LI水平及TRPV1表达的影响

3、讨 论

研究显示注射硝酸甘油可诱发大鼠行为变化，如抓头部、爬笼次数增加、身体颤抖等[19,20],这些行为变化在注射硝酸甘油后会持续2～3 h[21]。这可能是由于皮肤异常性疼痛可增加大鼠的梳理行为，因此偏头痛发作的常见症状。此外，硝酸甘油诱发的偏头痛在大鼠身上具有临床适用性[22,23]。

BTX-A通过蛋白水解裂解突触蛋白突触体相关蛋白(SNAP)-25,从而阻止神经递质的囊泡释放。SNAP-25作为突触蛋白复合物的一个重要组成部分，直接参与了Ca2+依赖性的胞吐过程[24,25]。BTX-A在周围神经末梢的这种作用是其治疗一系列与神经元过度活动相关的神经肌肉(眼睑痉挛、局限性肌张力障碍和痉挛)和自主神经(多汗症和膀胱功能障碍)疾病的基础[26]。颅骨注射BTX-A也已被批准用于治疗慢性偏头痛[27]。现在普遍认为，偏头痛与支配脑膜血管的三叉神经传入神经元的激活及硬脑膜神经源性炎症的发生有关[28]。本研究显示，BTX-A注射可显著改善偏头痛大鼠行为学。

研究显示，BTX-A通过作用于CGRP、SP-LI和TRPV1来发挥其作用[29～31]。三叉神经尾核内三叉血管神经元的中枢敏化被认为是偏头痛高敏性和慢性化发病机制中的一个关键因素。三叉神经血管通路的激活会导致促炎、血管扩张或产生疼痛的神经肽的释放，如CGRP、垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)等[32]。CGRP是一种血管扩张性神经肽，广泛表达于偏头痛相关结构，如三叉神经节和三叉神经尾核[33]。CGRP在偏头痛的病理生理学中起着关键作用，被认为是偏头痛的生物标志物[34]。TRPV1是一种辣椒素受体，在炎症、有害热(42℃ 时激活)和疼痛化学刺激下可被激活[35,36]。本研究强调了TRPV1离子通道在偏头痛病理生理学中发挥的关键作用。

综上，BTX-A能够显著抑制由硝酸甘油诱导的三叉神经血管系统中CGRP、SP-LI及TRPV1水平。这一发现揭示了BTX-A对偏头痛的潜在治疗机制，即通过抑制这些关键神经肽释放及TRPV1离子通道活性来发挥作用。因此，BTX-A有望成为一种具潜在的临床治疗方法，可用于缓解偏头痛症状，减少其发作频率，并可改善患者的生活质量。

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基金资助:黑龙江省卫生健康委科研课题(20210303070191);黑龙江省教育厅基金资助项目(2017-KYYWF-0587);

文章来源:张洪淞,阴育红,黄广为,等.A型肉毒杆菌毒素治疗偏头痛大鼠的疗效及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(22):5536-5540.