首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 肾内科论文 > 益肾活血解毒方预处理对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用

益肾活血解毒方预处理对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用

2024-06-07 9 上传者：管理员

摘要：目的：观察益肾活血解毒方预处理对大鼠急性肾缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)的保护作用并探讨其机制。方法：30只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组及益肾活血解毒方组(14.6 g·kg-1),采用经腹侧入路结扎双侧肾蒂(45 min)的方法建立急性肾IRI大鼠模型。术前7 d开始预处理给药，空白组和模型组给予生理盐水灌胃，每日1次。再灌注24 h后取材，检测血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)、血清胱抑素C(Cystatin C,CysC)水平；HE染色观察肾脏组织病理学变化并行肾小管损伤评分；透射电镜观察肾小管上皮细胞超微结构变化并计算病变指数；TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡情况并计算凋亡指数。结果：(1)与空白组比较，模型组大鼠血清BUN、SCr、CysC水平显著升高(P<0.05);与模型组比较，益肾活血解毒方组大鼠血清BUN、SCr、CysC水平显著降低(P<0.05)。(2)HE染色：模型组大鼠肾小管管腔明显扩张，肾小管上皮细胞大量坏死，肾间质呈现水肿状态伴有大量淋巴细胞浸润；与空白组比较，模型组大鼠肾小管损伤评分显著增加(P<0.05);与模型组比较，益肾活血解毒方组大鼠肾脏组织病理形态明显改善，肾小管损伤评分显著降低(P<0.05)。(3)透射电镜：模型组大鼠肾小管损伤严重，微绒毛脱落，细胞外基质浓集，伴随大量线粒体空泡变性和内质网扩张；与空白组比较，模型组大鼠肾小管上皮细胞超微结构病变指数显著升高(P<0.05);益肾活血解毒方组大鼠肾小管上皮细胞内存在少量线粒体肿胀和空泡变性，部分内质网扩张，肾小管上皮细胞超微结构病变指数较模型组降低(P<0.05)。(4)TUNEL:与空白组比较，模型组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数明显升高(P<0.05);与模型组比较，益肾活血解毒方组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)。结论：益肾活血解毒方预处理对大鼠急性肾IRI具有保护作用，其机制可能与减轻肾小管上皮细胞损伤、抑制肾小管上皮细胞凋亡有关。

关键词：
IRI
益肾活血解毒方
细胞凋亡
缺血再灌注损伤
肾脏
加入收藏

肾缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)是肾脏手术和肾移植的常见问题。肾IRI可能引发严重后果，包括移植肾功能延迟恢复(delayed graft function, DGF)、急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)、急性排斥反应(acute rejection, AR)以及慢性移植物肾病(chronic allograft nephropathy, CAN),这些已成为影响急性肾衰竭患者和肾移植受者长期存活的关键问题[1]。目前，肾IRI尚无特效治疗药物，因此广大学者日益关注肾IRI的防治措施。肾IRI的中医病机是本虚标实、气虚血瘀，治宜补气扶正、活血化瘀[2]。本研究首先建立急性肾IRI大鼠模型，然后采用益肾活血解毒方预处理，观察其对肾IRI大鼠的肾脏保护作用，以期为益肾活血解毒方防治肾IRI的临床与实验研究提供基础依据。

1、材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠30只，体质量180～220 g, 购自山东济南朋悦公司，许可证号：XCXK(鲁)2014-0007。大鼠饲养于标准IVC隔离式笼具中，自由进食和饮水，环境温度20～25 ℃,相对湿度45%～70%,光暗循环为12 h/12 h, 定期更换大鼠垫料。本实验由河南中医药大学动物伦理委员会审核批准，伦理批号：DWLL202107014。

1.2 药物与试剂

益肾活血解毒方(黄芪、当归、积雪草、川芎、白花蛇舌草、白芍，由河南中医药大学第一附属医院提供);4%多聚甲醛、环保型脱蜡透明液、苏木素-伊红染色试剂盒(武汉塞维尔公司，货号：G1101、G1128、G1076);水合氯醛(上海邦景实业有限公司，货号：103472-25-9);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司，货号：AT005-3);中性树脂(天津市光复精细化工研究所，货号：gfsz025);酒精(德国默克公司，货号：51976);石蜡(南通云程实验器械有限公司，货号：TM610001116149)。

1.3 仪器

防脱载玻片(武汉博士德生物工程公司，货号：AR1065);无创血管夹(北京合力科创科技发展有限公司，型号：HL-DMJ);制冰机(意大利SCOTSMAN,型号：AF124);超低温冷冻柜(美国Thermo Fisher Scientific, 型号：UXF40086A);石蜡包埋机、恒温摊片烤片机(湖北泰维科技公司，型号：TB-718D、TK-218IV);旋转切片机(德国Leica, 型号：RM2245);光学显微镜、全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司，型号：BX53M、AU640);离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-5-Z)。

2、方法

2.1 大鼠急性肾IRI模型的建立

术前禁食12 h, 以10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL·kg-1)麻醉大鼠，呈仰卧位固定在手术台上；沿腹正中线打开大鼠腹腔，充分游离双侧肾蒂，并用无创夹经腹侧入路夹闭双侧肾蒂(45 min);取下血管夹，肾脏颜色由紫红变为红色，表示肾IRI模型建立成功。

2.2 药物制备

益肾活血解毒方组成包括：黄芪15 g, 当归10 g, 积雪草15 g, 川芎10 g, 白花蛇舌草15 g, 白芍10 g。由河南中医药大学第一附属医院制作中药浸膏，每克浸膏含生药1.848 g, 4 ℃保存备用。

2.3 分组及给药

30只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组及益肾活血解毒方组，每组各10只。手术前7 d开始预处理给药，益肾活血解毒方的灌胃剂量为14.6 g·kg-1,由成人(60 kg, 每天88 g生药)与动物等效剂量换算得出[3]。空白组、模型组给予生理盐水(10 mL·kg-1)灌胃，每日1次。空白组仅游离双侧肾蒂不作夹闭处理，模型组和益肾活血解毒方组采用2.1项方法建立模型，再灌注 24 h 后取材。

2.4 肾功能检测

10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL·kg-1)麻醉大鼠，打开大鼠胸腔，充分暴露心脏，行心尖采血，离心(3 000 r·min-1)10 min后，取上清，置于-20 ℃冰箱保存备用。采用苦味酸不除蛋白法检测血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平，酶联免疫吸附法检测血清肌酐(serum creatinine, SCr)水平，颗粒增强透射免疫分析法检测血清胱抑素C(Cystatin C,CysC)水平。

2.5 HE染色观察肾脏组织病理学变化

打开大鼠腹腔，切取并冲洗肾脏，置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h; 沿肾脏冠状轴将其切成两半，按照脱水、透明、浸蜡等步骤制作石蜡切片(4 μm);切片经过脱水、透明、封片等步骤处理后，在相差光学显微镜下观察。每只大鼠选取一张切片，400倍放大倍数下随机选取10个视野，采用Paller半定量病理评估法对肾小管损伤程度进行评分，标准[4]见表1。

表1 肾小管损伤病理评分标准

2.6 透射电镜观察肾小管上皮细胞超微结构变化

取大鼠肾脏5 min内，将其修成大小约1 mm3的组织块，在2.5%戊二醛溶液中固定48 h, 4 ℃冰箱中保存。制备电镜切片时，取出肾脏组织，2.5%戊二醛溶液浸泡4 h后，磷酸盐缓冲液冲洗4次，每次15 min; 1%锇酸固定1.5 h, 然后用乙醇梯度脱水。肾脏组织包埋后进行半薄切片定位，然后制作超薄切片，厚度50 nm。最后，在透射电镜下观察肾小管上皮细胞超微结构，并计算超微结构病变指数。

肾小管上皮细胞超微结构病变指数=异常细胞数目/正常细胞数目×100%

2.7 TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡情况

根据TUNEL凋亡试剂盒说明书进行操作，具体流程如下：将石蜡切片进行脱蜡处理，切片滴加蛋白酶K溶液，室温孵育20 min增加样本通透性；配制标记反应液，包括FITC-标记反应混合物48 μL和TdT 酶2 μL,并进行标记反应；滴加50 μL DAPI染色液，避光条件下去除多余液体，立即在荧光显微镜下采集图像。利用Image Pro Plus软件计算各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数。

细胞凋亡指数=凋亡细胞数目/细胞总数×100%

2.8 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布的多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；若数据不符合正态分布，采用非参数秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 益肾活血解毒方对大鼠肾功能的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清BUN、SCr、CysC水平升高(P<0.05);与模型组比较，益肾活血解毒方组大鼠血清BUN、SCr、CysC水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清BUN、SCr、CysC水平比较

3.2 益肾活血解毒方对大鼠肾脏组织病理的影响

HE染色结果显示，空白组大鼠肾组织病理形态未见明显异常；模型组大鼠肾小管管腔明显扩张，肾小管上皮细胞大量坏死，肾间质呈现水肿状态伴有大量淋巴细胞浸润；与空白组比较，模型组大鼠肾小管损伤评分增加(P<0.05)。益肾活血解毒方组大鼠肾组织可见部分肾小管管腔轻度扩张，肾间质可见少量淋巴细胞浸润；与模型组比较，益肾活血解毒方组大鼠肾小管损伤评分降低(P<0.05)。见图1、表3。

图1 各组大鼠肾脏组织病理图(HE染色，×400)

表3 各组大鼠肾小管损伤评分

3.3 益肾活血解毒方对大鼠肾小管上皮细胞超微结构的影响

透射电镜结果显示，空白组大鼠肾小管上皮细胞超微结构基本正常，微绒毛排列整齐，线粒体膜完整；模型组大鼠肾小管损伤严重，微绒毛脱落，细胞外基质浓集，伴随大量线粒体空泡变性和内质网扩张；与空白组比较，模型组大鼠肾小管上皮细胞超微结构病变指数升高(P<0.05)。益肾活血解毒方组大鼠肾小管上皮细胞内存在少量线粒体肿胀和空泡变性，部分内质网扩张，肾小管上皮细胞超微结构病变指数较模型组降低(P<0.05)。见图2、表4。

表4 各组大鼠肾小管上皮细胞超微结构病变指数

图2 各组大鼠肾小管上皮细胞超微结构图(×16 500)

3.4 益肾活血解毒方对大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数升高(P<0.05);与模型组比较，益肾活血解毒方组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数降低(P<0.05)。见图3、表5。

图3 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡图

表3 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数

4、讨论

肾IRI是指由于各种原因导致肾脏血流中断，并在恢复血液灌注或氧供后产生的损伤作用[5]。肾IRI是肾移植中面临的主要问题和挑战之一，严重影响肾移植受者的生活质量和移植肾功能的恢复[6]。近年来，随着肾移植手术的广泛开展，肾IRI作为影响移植术后恢复的重要因素越来越受到关注。肾IRI的发生机制十分复杂，涉及多种病理过程，包括氧自由基的过量生成、细胞内Ca2+超载、细胞凋亡、炎症反应、微循环障碍等[7,8,9]。其中，细胞凋亡在肾IRI的发生发展过程中具有重要作用[10]。

近年来，肾IRI的防治研究已取得显著进展，其中启动肾脏内源性保护机制的研究(如各种预处理和预适应方法)尤为重要[11]。此外，通过使用激活或抑制体内特定信号通路及细胞因子的药物以减轻肾IRI,对于促进移植肾功能的早期恢复和患者的长期存活具有重要意义。尽管这些药物不能彻底治愈肾IRI,但他们仍然是探索防治肾IRI的重要途径。目前大多数研究仍处于尝试性用药或基础实验阶段，系统化的整理和总结工作也相对缺乏。因此，迫切需要研发一种高效、经济、低毒且能与免疫抑制剂协同作用的药物，以减轻肾IRI。中医药因其多靶点、多途径、不良反应小等优势，在肾IRI的防治方面展现出良好的应用前景。

中医学虽无肾IRI的概念，但根据相关中医证候，可将其归属于“腰痛”“水肿”“血证”等范畴[12]。本病的主要病机属本虚标实，多因气虚、血瘀、毒聚所致[2,13]。在肾IRI过程中，体内血流动力学发生显著变化，免疫反应介导的凝血机制被激活，凝血酶原加速活化为凝血酶，导致肾脏组织内大量纤维素沉积，并刺激血小板凝集。整个血栓形成过程和肾脏病理形态学改变(如纤维蛋白样物质沉积、细胞外基质沉积等)均可涵盖于“内结为血瘀”“气虚血瘀”“湿毒内阻”等中医证候。著名肾脏病专家张翥教授认为，缺血再灌注导致移植肾损伤的主要病机特点是肾气亏虚、瘀毒内阻，治疗应以“益肾、活血、解毒”为第一要务，并据此拟定益肾活血解毒方。方中当归、黄芪配伍以益气养血，积雪草、白花蛇舌草配伍以清热解毒，白芍、川芎配伍以活血化瘀，共奏益肾活血、解毒利湿之功[14]。药理学研究证实，方中药物具有抗肾纤维化、保护肾功能、抗炎、抑制细胞凋亡、改善微循环等多重功效[15,16,17,18,19]。临床研究表明，益肾活血解毒方能够减轻移植肾损伤患者的尿蛋白水平，改善肾功能[20,21]。因此，益肾活血解毒方的上述药理作用为防治肾IRI提供了理论依据。

本研究建立急性肾IRI模型，并应用益肾活血解毒方对大鼠进行预处理给药。结果显示，益肾活血解毒方组大鼠的肾功能得到改善，肾小管损伤病理评分和肾小管上皮细胞超微结构病变指数均降低，这表明益肾活血解毒方可减轻由肾IRI导致的急性肾损伤。此外，益肾活血解毒方组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数下降，提示该方能够提高肾IRI大鼠的抗凋亡能力。

综上所述，益肾活血解毒方预处理对大鼠急性肾IRI具有保护作用，其机制可能与减轻肾小管上皮细胞损伤、抑制肾小管上皮细胞凋亡有关。因此，益肾活血解毒方有望成为肾IRI的保护剂。本研究初步为益肾活血解毒方防治肾IRI提供理论依据，但其具体机制及量效关系有待深入探索。

参考文献:

[2]荆小马,曹先德.中医药防治肾缺血再灌注损伤研究进展[J].云南中医中药杂志,2018,39(12):75-77.

[3]施新猷.医用实验动物学[M].西安:陕西科学技术出版社,1989:417.

[12]费洁,陶富盛,解珂.肾缺血再灌注损伤发生机制的中西医认识进展[J].黑龙江医药,2008,21(2):45-47.

[13]陈菡,胡晓松.活血､补气中药抗肾缺血再灌注损伤作用机制研究进展[J].环球中医药,2012,5(1):63-66,71.

[14]王锁刚,马继伟,刘浩飞,等.张翥辨治慢性移植肾损伤经验[J].河南中医,2019,39(12):1824-1827.

[15]王帝,王光策.活血化瘀中药抗肾缺血再灌注损伤实验研究进展[J].中医研究,2018,31(4):73-76.

[17]张珂胜,陈凌波,黄小平,等.黄芪和当归配伍对小鼠造血干细胞衰老模型细胞增殖的影响[J].中国中药杂志,2017,42(21):4187-4194.

[18]王娜,许海江,赵春玲.川芎嗪对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制[J].山西中医学院学报,2016,17(4):19-21.

[19]汪绪祥,王锁刚,翟琼瑶,等.积雪草颗粒对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[J].中医学报,2020,35(5):1045-1049.

[20]王锁刚,娄丽霞,张楠,等.益肾活血解毒方联合免疫抑制方案治疗肾移植后蛋白尿的疗效评价[J].中国中西医结合肾病杂志,2020,21(8):712-714.