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非诺贝特对阿霉素诱导肾病模型大鼠的肾脏保护作用机制

2024-07-27 19 上传者：管理员

摘要：目的研究非诺贝特对阿霉素诱导的肾病模型大鼠血脂、肾脏功能和形态的改变以及氧化应激、炎症、凝血因子的影响，探讨非诺贝特的肾脏保护作用并分析其机制。方法将30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组，分别于实验第1天、第7天尾静脉注射阿霉素4 mg/kg、2 mg/kg,制备肾病综合征大鼠模型，正常对照组尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液。造模第8周后，治疗组大鼠给予非诺贝特(60 mg/kg)水溶液灌胃，其余2组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。观察3组大鼠的一般状态、饮食、尿量及体重等变化。收集大鼠24 h尿液，利用考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白定量。实验结束后留取肾组织及血液标本，HE染色观察肾组织病理改变，生化分析仪检测3组大鼠血清肌酐(CRE)、血尿素氮(BUN)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平，试剂盒检测3组大鼠肾组织匀浆中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平，酶联免疫吸附法检测血清C反应蛋白(CRP)和血浆纤维蛋白原(FG)水平。结果与正常对照组比较，模型组大鼠一般状态差、体重逐渐减轻、24 h尿蛋白水平、血清CRE、BUN、TC、TG水平显著升高，肾小球及肾小管形态异常，表明肾病综合征大鼠模型制备成功；非诺贝特可显著改善肾病综合征模型大鼠的肾脏病理改变，治疗组大鼠体重较同期模型组普遍偏高，第8周时，2组间差异有统计学意义(P<0.01),24 h尿蛋白水平较同期模型组明显降低，第8周末更为显著(P<0.01),血清CRE、BUN、TC、TG水平显著降低，2组间差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，治疗组大鼠肾组织中MDA含量显著降低，GSH-Px、SOD活性显著升高，血清CRP和血浆FG水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。结论非诺贝特可能通过降低肾病综合征大鼠血脂及氧化应激、炎性因子和凝血因子的表达水平，对阿霉素诱导的肾病模型大鼠起到一定的肾脏保护作用。

关键词：
大鼠
抗凝治疗
氧化应激
炎症
肾病综合征
非诺贝特
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肾病综合征(nephrotic syndrome, NS)是由一组具有类似临床表现，不同病因及病理改变的肾小球疾病构成的临床综合征，常表现为大量蛋白尿、高度水肿、高脂血症及低蛋白血症等典型症状，可引起肾功能损害、细菌感染、蛋白质及代谢紊乱等[1]。肾病患者容易出现糖脂代谢的紊乱，患者如果出现高血脂应该进行治疗，因为高血脂反过来又会对肾脏疾病造成影响[2]。近年来，降脂治疗开始用于延缓肾脏疾病进展的治疗，但是尚缺乏大规模的临床试验来证实[3]。非诺贝特(fenofibrate)是第三代苯氧芳酸衍生物类调血脂药物，能显著降低三酰甘油(TG),中度降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),并能升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),也是目前贝特类中使用最多的药物[4]。研究表明，非诺贝特除具有较好的降脂效果以外，还具有一系列除调脂以外的作用，而且这些作用可成为临床上治疗肾病不可或缺的有利因素[4-7]。本研究通过多次尾静脉注射阿霉素(Adriamycin, ADR)诱导大鼠肾病综合征模型，并利用非诺贝特干预，观察非诺贝特对肾脏的保护作用并探讨可能的机制，为其应用于临床治疗肾病综合征提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

10周龄雄性SD大鼠30只，体重180～220 g,购自吉林大学基础医学院实验动物中心(SYXK:2018-0001)且研究方案通过该中心实验动物伦理审批(2022年研审第531号),大鼠自由饮水、进食、活动，适应性饲养1周。

1.2实验药物及试剂

阿霉素、非诺贝特购自美国Sigma Aldrich公司；苏木素-伊红染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠C反应蛋白(CRP)检测试剂盒、大鼠纤维蛋白原(FG)试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.3动物模型制备、分组及给药方法

30只大鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组，每组10只，分别于实验第1天、第7天尾静脉注射阿霉素4 mg/kg、2 mg/kg,予正常对照组尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液。模型组动物于第2次注射后第7天可产生大量蛋白尿，第14天时蛋白尿更明显，同时可出现大量腹水，并出现低蛋白血症、高胆固醇血症，即为造模成功。给予标准饲料、充足的饮用水饲养，用于下一步的实验。造模第8周后，治疗组大鼠给予60 mg/kg非诺贝特水溶液灌胃，其他2组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。连续干预8周，每周检测1次24 h尿蛋白定量。

1.4一般状态观察

每日观察动物精神状态、毛色、饮食情况、尿量、活动情况，每周称量1次各组大鼠体重。

1.5标本采集及处理

代谢笼收集大鼠24 h尿液，留尿期间禁食，不禁水。记录尿量后留取3 mL,离心去除沉渣，分装于Eppendorf管中；实验结束时处死3组动物，眼球取血，分离血清及血浆分装于Eppendorf管中。大鼠处死后立即摘取肾脏，左右肾去除包膜，0.9%氯化钠溶液洗去血迹后称重，用锋利刀片将肾脏自肾门处冠状切面对半剖开，一半用于制备肾组织匀浆，另一半肾脏放入4%多聚甲醛中固定48 h,常规制备石蜡包埋切片。

1.6生化指标检测

一般状态观察：每天观察动物精神状态、毛色、饮食情况、尿量、活动情况，每周称量1次3组大鼠体重；考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白定量；日立7150型全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(CRE)、血尿素氮(BUN)、胆固醇(TC)、TG水平。

1.7 HE染色观察肾组织病理改变

石蜡切片脱蜡至水，入苏木素染液中染3～5 min,自来水冲洗，1%的盐酸乙醇分化，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。伊红染液中染色1～3 min,自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察肾脏形态学变化。

1.8氧化应激指标检测

试剂盒检测3组大鼠肾组织匀浆中MDA、GSH-Px、SOD、CAT水平，按照试剂盒说明书操作。

1.9炎症及凝血功能指标检测

酶联免疫吸附(ELISA)检测大鼠血清CRP和血浆FG水平，按照试剂盒说明书操作。

1.10统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件，计量资料服从正态分布以

表示，2组间比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 3组大鼠一般状况

正常对照组大鼠饮食饮水及大小便正常，精神状态良好，毛色致密有光泽，反应敏捷，无死亡。模型组大鼠治疗从第3周起出现明显的活动减少，体毛枯燥无光泽，精神萎靡，反应迟钝，状态差，死亡3只。与模型组相比，治疗组大鼠出现上述症状的时间有不同程度的延迟，总体状态及活跃程度好于模型组，死亡1只。

2.2 3组大鼠体重变化

随着实验进展，正常对照组大鼠体重逐渐增加，而模型组大鼠体重逐渐减轻，治疗第4及第8周时，与正常对照组比较，模型组大鼠体重显著减轻，2组间差异有统计学意义(P<0.05);非治疗组大鼠体重较同期模型组普遍偏高。见表1。

2.3 3组大鼠尿蛋白变化

治疗第4及第8周时，与正常对照组比较，模型组大鼠24h尿蛋白水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01);与模型组比较，治疗组大鼠治疗第4、8周24h尿蛋白水平较同期模型组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠体重及24h尿蛋白变化

2.4 3组大鼠血液生化指标变化

治疗第8周实验结束后，与正常对照组比较，模型组大鼠血清CRE、BUN、TC、TG水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，治疗组大鼠血清CRE、BUN、TC、TG水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠血液生化指标比较

2.5 3组大鼠肾组织病理改变

光镜下可见正常对照组大鼠肾小球形态无明显异常，血管壁正常，毛细血管袢开放，肾小球囊无渗出及粘连，肾间质无明显的炎细胞浸润，近端肾小管结构正常；模型组大鼠可见肾小球系膜基质增生，肾小囊腔呈裂隙状，毛细血管受压而塌陷，肾小管管腔扩张，间质纤维组织增生伴大量炎性细胞浸润，近曲小管上皮细胞坏死，可见管型；治疗组大鼠较模型组有很大程度改善，病变程度减轻，肾小球增大不明显，仅有轻度系膜增生，肾小管结构恢复较好，炎性细胞浸润明显减少。见图1。

图1 3组大鼠肾组织病理改变(HE×200)

2.6 3组大鼠肾组织氧化应激水平比较

模型组大鼠肾组织匀浆中MDA的含量较正常对照组明显升高，GSH-Px、SOD、CAT活性显著降低，非诺贝特给药可显著提高GSH-Px、SOD及CAT的活性，降低模型大鼠肾组织中MDA的含量，治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.7 3组大鼠血液中炎症指标及凝血功能指标比较

与正常对照组比较，模型组大鼠血清CRP水平和血浆FG水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，治疗组大鼠血清CRP水平和血浆FG水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 3组大鼠肾组织MDA含量及GSH-Px、SOD、CAT活性

表4 3组大鼠血清CRP和血浆FG水平

3、讨论

肾病综合征患者出现蛋白尿，明显水肿，甚至出现胸腔积液、腹腔积液和心包积液，患者出现胸闷气促等症状。血液浓度高，高脂血症引起血液黏度增加，低蛋白血症导致肝合成蛋白增加，引起机体抗凝、凝血和纤溶紊乱，血小板功能亢进，使用利尿剂等引起高凝，因此患者容易发生血栓形成和栓塞[8]。随着病情的发展，患者的肾脏逐渐受损。引发肾功能下降。部分患者，最终可能发展为尿毒症[9]。他汀类和贝特类药物都是临床上重要的心血管保护药物，其不依赖降脂作用而产生的肾脏保护作用越来越多地被人们所发现。非诺贝特在心血管和肾脏保护方面的基础研究及循证依据少于他汀类药物。尽管临床医生在治疗合并高三酰甘油血症的肾病综合征患者时会应用到非诺贝特，但主要为了利用其降脂作用，对非诺贝特是否有益于延缓肾病的终末期进展以及治疗的适应证如何把握等缺乏科学理论的指导。

阿霉素是临床上常用的一种含醌式结构的抗肿瘤药物。阿霉素诱发大鼠肾病是一个较经典的肾病模型[10]。采用6 mg/kg体重大剂量一次性注射阿霉素的方法可诱导急性肾衰竭(Acute renal failure, ARF)模型，其发病机制主要与机体氧自由基、脂质过氧化损伤有关。ADR肾病模型已由最初的单次给药，逐渐到以后的各种不同改良方法，模型制备技术逐渐成熟。多次注射ADR可诱发局灶性节段性肾小球硬化，后期(7～16周)可建立慢性肾病模型[11],许涛等[12]通过给大鼠两次静脉注射阿霉素的方法，复制出大鼠肾病综合征的模型，并连续观察12周，发现造模6周后，大鼠肾病理改变类似于微小病变型肾病，到造模12周时，已有肾小球硬化的改变出现。本研究采用阿霉素诱导8周后成功获得阿霉素肾病模型大鼠，后续整个实验过程中，模型组大鼠的24 h尿蛋白稳定在较高水平，体重减轻、食欲不振、精神萎靡等肾病症状明显。模型组大鼠的血脂、血清肌酐、尿素氮、尿蛋白水平等均较正常对照组明显增加，光镜下见肾小球系膜基质增生，肾小球硬化，毛细血管受压而塌陷，肾小管管腔扩张，间质纤维组织增生，近曲小管上皮细胞坏死等病理改变，表明成模的肾病大鼠已进入慢性期。给予非诺贝特处理后，治疗组大鼠的一般状态较模型组有所好转，肾脏的病理改变明显减轻。通过较长时间的治疗(连续8周),非诺贝特不但可以明显降低肾病模型大鼠的胆固醇及三酰甘油水平，而且对肾功能指标血肌酐、尿素氮均有一定改善作用。以上实验结果表明，非诺贝特对肾病综合征模型大鼠具有一定的肾脏保护作用，能减轻肾小球硬化、基膜增厚、肾小管扩张等肾脏病理改变，降低尿白蛋白，从而延缓肾病的进展和恶化。

高血压、高血糖、高血脂可以加快肾小球疾病的进展，因这三者最主要的风险就是血管动脉硬化，当肾脏血管硬化以后，肾脏血量就会减少，出现肾小球的供血的能力下降，这样就会加重肾小球的硬化，最后使肾脏病发生进展[13-14]。近年来降脂治疗开始用于延缓慢性肾脏疾病进展的治疗，最常用的就是他汀类药物。他汀类药物在CKD防治中的多效作用，主要包括改善血脂代谢紊乱、减少炎性反应、氧化应激和纤维化、改善内皮功能，改善血流动力学、降低血清终末糖化产物(AGEs)、降低血压等作用[15-16]。非诺贝特是第三代苯氧芳酸衍生物类调血脂药物，也是目前贝特类中使用最多的药物。目前，因大量临床试验证据的支持，非诺贝特在临床上逐渐得到了人们的重视。有研究表明，非诺贝特具有抗动脉粥样硬化的作用，其机制与过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)的激活密切相关[17]。非诺贝特的这种作用，不仅与调脂作用有关，还在于其能改善非脂质性危险因素。例如抗炎、降低纤维蛋白原及部分凝血因子水平、改善胰岛素敏感性、改善内皮细胞功能等调脂以外的作用[18-20]。本次研究从不同角度证实了非诺贝特的肾脏保护作用机制，不足之处在于仍未考虑大鼠的肾功能情况并给予个性化的剂量，因此需下一步开展更为细致的基础或临床研究，从而为临床用药提供更为明确的指导意见。

综上所述，非诺贝特可改善肾病综合征模型大鼠的一般状态，降低血脂，改善肾病综合征大鼠的肾功能，降低尿蛋白排泄。非诺贝特处理后，肾病综合征大鼠肾脏的病理改变明显减轻，肾小球纤维化及炎性细胞浸润明显减少。非诺贝特可能通过降低肾病综合征大鼠氧化应激、炎性因子及凝血因子的表达水平，来起到保护肾脏功能的作用。

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基金资助:吉林省卫生健康科技能力提升项目(编号:2017Q006);