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实时荧光PCR法定量基础上检测食品中鸡源性成分

2020-08-11 499 上传者：管理员

摘要：肉类食品真伪鉴定是目前食品安全检测领域的重点研究内容之一。为准确定量检测食品中的鸡源性成分,根据现行检验检疫标准(SN/T2727—2010)合成引物及探针,并拓展了特异性、灵敏度、检出限和定量分析等试验。结果显示:特异性试验中,仅鸡成分检测出现特异性扩增,其他动物组织均未出现特异性扩增;梯度稀释鸡源性DNA模板原液进行灵敏度评价,发现引物和探针灵敏度较高,可以检测到100fg级的鸡组分模板DNA,且建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2达0.99以上,定量准确;加工制品中的验证试验结果显示,合成的引物及探针具有良好的适用性和定量检测能力。以上研究结果均说明,此引物和探针适用于市场食品中鸡源性成分的定性、定量检测。本研究为今后TaqMan实时荧光PCR法不同动物源性引物和探针的自主研发奠定了基础。

关键词：
TaqMan实时荧光PCR
定量分析
检出限
灵敏度
特异性
鸡源性成分
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在现今的商品经济时代，各种肉食营养价值、销售价格以及生产量、消费量的不同，导致不同源性肉品价格存在巨大悬殊，致使一些不法商贩、企业的违法掺假造假行为时有发生。2013年，欧洲一些肉食品生产商在生牛肉中掺入马肉[1]，曾一度引发社会对食品掺假的舆论谴责。同时，也因疏忽错贴标签而发生一些高商业价值肉制品被误列为低价值肉类的事件[2]。上述事件带来的经济、宗教问题[3,4]越来越受到社会各界的关注。因此，对肉类成分进行物种鉴别，使标签正确化，变得越来越重要。

目前，对于肉类掺假的检测主要是基于蛋白质[5,6]、DNA[7,8,9,10,11,12]以及脂肪[13,14]进行。而蛋白质分析法又包括电泳法[15,16]、色谱法[17]、质谱法[18]、酶联免疫分析法[19]和蛋白质组学法[20]等。这些蛋白质分析方法虽然能够对肉制品成分进行定性、定量分析，但是并不适用于经过高温加工导致蛋白质变性的产品。而DNA在强烈的加热处理后仍能保持稳定性[21]，因此现今多数肉制品成分检测技术都基于DNA检测，其中以PCR技术最常见[22,23]。荧光定量PCR技术因特异性好，检测自动化程度高，已成为现今种属鉴定的主流技术之一。本试验采用TaqMan探针法，参照现行检验检疫行业标准SN/T2727—2010[24]合成引物及探针，建立鲜肉及加工制品中鸡源性成分的TaqMan实时荧光PCR检测方法，并针对标准进行了试验体系优化和DNA提取方法改进，大大提高了检测效率并且节省了耗材成本。本研究旨在快速、准确检测食品市场中的鸡源性成分，以期为肉制品质量控制提供快速、有效的手段。

1、材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料采集及准备

试验所需鲜肉及加工制品材料，采购于锡林浩特市本地市场及大型超市。样品采集后，除去明显脂肪，并用灭菌水清洗，-20℃冰箱保存。鲜肉样品包括：鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、马肉、驴肉、鹿肉、兔子肉、狗肉、鸭肉、鸽子肉、火鸡肉和鱼肉；加工制品包括：鸡蛋、双汇火腿肠、金锣火腿肠、金锣烤肠、肉粒多猪肉肠、尚清斋烤肠、鸭烤翅、鸭腿、鸭蛋、鹌鹑蛋、蒙羊肉干、呼纳斯牛肉干。

1.1.2 主要仪器与试剂

7300plus实时荧光PCR扩增仪，美国ABI公司；Nanodrop2000c核酸蛋白测定仪，美国ThermoFisher公司；5418R高速台式离心机，德国EppendorfAG公司；凝胶成像系统和T100PCR扩增仪，美国Bio-Rad公司。TransStartProbeqPCRSuperMix，北京全式金生物技术有限公司；qPCR引物和探针合成，北京睿博兴科公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探针

根据标准SN/T2727—2010设计，委托北京睿博兴科公司合成，其中探针所用的荧光标记基团为FAM(6-羧基荧光素）。引物与探针序列见表1。

表1引物和探针序列

1.2.2 DNA提取

用剪刀对1.1.1中的试验材料进行取样处理，利用溴化十六烷三甲基铵（cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB）法提取DNA[25,26]。方法具体如下：取预先处理好的样品约50mg放入1.5mL离心管中，加入800μLDNA裂解液，进行旋涡混匀，于65℃金属浴裂解30min，中途取出混匀数次；将金属浴后的管内全部体系置于离心机，13000r/min离心5min后，转移上清液至新的洁净离心管中；向上清液中加入等体积三氯甲烷/异戊醇（V/V,24/1）混合液，置于涡旋振荡仪上涡旋30s，混匀后13000r/min离心5min；取上清液于新的离心管中并加入等体积的异丙醇，充分混匀，13000r/min离心5min，弃去上清；将管内的沉淀用75%乙醇充分洗涤2次，晾干，加入适量的灭菌双蒸水，然后利用Nanodrop2000c核酸蛋白分析仪，测量其浓度及质量，并将样品母液稀释至100ng/μL左右，且使A260/A280在1.8～2.0之间，-20℃保存留用。

1.2.3 反应体系与反应条件

实时荧光PCR平台反应总体系20μL，组分包括：TransStartProbeqPCRSuperMix10μL，左右引物各1μL(10μmol/L），探针1μL(10μmol/L），模板DNA2μL，补充灭菌双蒸水至20μL。反应条件：95℃预变性5min;95℃变性10s,52℃退火32s,40个循环。在每次循环退火时收集荧光信号。

1.2.4 特异性试验

提取1.1.1中的13种鲜肉组织样品DNA，利用荧光定量PCR进行特异性检测。根据典型扩增曲线和各反应体系循环阈值（cyclethreshold,Ct），验证鸡源性引物和探针对于不同动物DNA模板的特异性。

1.2.5 检出限检测试验

用灭菌双蒸水，对100ng/μL的鸡鲜肉组织原液模板DNA进行10倍梯度稀释，使DNA浓度依次为102～10-5ng/μL，然后以不同稀释浓度的样品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应。反应体系及条件同1.2.3。

1.2.6 灵敏度检测

将鸡、鹅组分DNA按一定比例混合，制成鸡组分含量分别为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%的DNA均匀混合样品，然后按照1.2.3反应体系及条件，上机验证引物和探针灵敏度。

1.2.7 加工制品中鸡源性成分检测

提取从超市购买的鸡蛋、双汇火腿肠、金锣火腿肠、金锣烤肠、肉粒多猪肉肠、尚清斋烤肠、鸭烤翅、鸭腿、鸭蛋、鹌鹑蛋、蒙羊羊肉干、呼纳斯牛肉干等样品的DNA，进行荧光定量PCR(TaqMan探针方法）扩增试验。

1.2.8 数据处理

利用ABI7300plus实时荧光PCR扩增仪自带分析软件，对结果进行扩增曲线和Ct值分析。每次试验设3个平行，数据均以平均值±标准差表示。

2、结果与分析

2.1 引物与探针的特异性验证

以13种鲜肉组织DNA为模板，按1.2.3中的反应条件及程序进行荧光定量PCR(TaqMan探针方法）扩增，验证鸡源性成分引物和探针的特异性。由表2可知，DNA样品浓度及质量均能满足试验要求。图1显示，5个鸡肉样品，每个样品3个平行试验中，仅鸡源性样品有明显扩增曲线，且样品1～5的Ct值分别为14.47±0.22、14.40±0.36、15.43±0.06、16.98±1.07、19.56±1.10，而以其他12种样品DNA为模板的反应体系均未检测到荧光信号，说明本方法中的引物和探针特异性较好。

表2鸡源性成分引物和探针的特异性检测结果（n=3)

图1鲜肉样品中鸡源性成分的TaqManPCR检测结果

2.2 检出限检测及定量分析

鸡源样品DNA原液10倍梯度稀释（102～10-5ng/μL）后的实时荧光定量PCR扩增试验结果如图2和表3所示。当样品模板稀释至10-4ng/μL（即100fg/μL）时，鸡源样品基因组DNA样本（3个平行试验）仍出现典型扩增曲线，且Ct值为35.78±0.95。本试验以Ct<40判定为确认检出，而当样品质量浓度为10-5ng/μL时，并未检测到鸡源性成分，因此本试验的鸡特异性引物和探针检测限度可达到100fg/μL。利用△Ct法进行相对定量，对鸡肉样品DNA进行梯度稀释，以Ct值为纵轴、模板DNA浓度的对数值为横轴，得到回归方程y=-3.7508x+43.428,R2=0.9961，线性相关系数>0.99（图3），表明具有较好的线性关系；通过欧洲转基因实验室网络（EuropeanNetworkofGMOLaboratories,ENGL）指南，可计算出上述反应的扩增效率为85%，因此从获取的Ct值可推算出初始DNA浓度及百分数。

图2鸡源成分模板DNA检出限检测结果

表3鸡源成分引物和探针检出限检测结果（n=3)

图3鸡源成分定量检测标准曲线

2.3 灵敏度检测

将鸡源成分DNA和鹅源成分DNA按照不同比例混合（鸡源成分含量分别为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%）进行的荧光定量PCR扩增试验结果如图4、表4所示。当混合DNA样中鸡源成分含量为0.0001%时，也出现典型的扩增曲线，Ct值为35.32±0.11，证明了鸡源成分引物和探针灵敏度较高。

图4灵敏度检测结果

表4鸡源成分引物和探针的灵敏度检测结果

2.4 加工制品中鸡源性成分检测

从1.1.1的加工制品中提取样品DNA，进行TaqManPCR检测。结果（表5、图5）显示，只有鸡源性制品（3个平行试验）出现特异性扩增曲线，Ct值分别为19.39±0.42（鸡蛋）、14.13±0.04（双汇火腿肠）、13.98±0.05（金锣火腿肠），其余制品均未检出，说明此引物和探针具有较高的适用性，可用于市售加工制品中的成分检测。

表5鸡源成分引物和探针的适用性检测结果（n=3)

图5引物和探针在加工制品中的适用性检测结果

3、讨论

TaqManPCR技术与普通PCR技术相比，试验步骤简单，试验时间少，只需一次PCR反应就可以完成对目标片段的定性和定量检测。Cheng等[27]利用多重实时荧光PCR方法鉴定和量化我国血豆腐产品中猪、鸡、鸭的DNA含量，发现该方法对DNA的检测限能达到0.15ng/μL，与传统方法相比，具有更高的灵敏度。本试验根据行业标准（SN/T2727—2010）合成引物和探针，进行DNA模板定量分析，通过绘制标准曲线，能够快速分析出样品中是否含有鸡源性并可进行定量，而且证明了此探针和引物组合具有较强的特异性。汪永信等[28]利用双重实时荧光PCR检测食品及饲料的鸡源性成分，检测限达到1ng/μL，而本研究的检出限达到100fg/μL。定量检测制作的标准曲线显示，R2>0.99，说明标准曲线纵横坐标间的线性关系较好，扩增效率达到85%，充分说明本试验方法可进行定量分析。本试验的灵敏度可达到0.0001%，证明此引物与探针组合具有较高的灵敏度。加工制品的检测结果表明，只有标有鸡源性的样品具有明显的扩增曲线，说明本试验使用的引物及探针适用性很强，可用于市售加工制品的成分检测。

4、结论

研究表明，本试验的引物和探针组合特异性强、灵敏度高、适用性广，可为食品中鸡源性成分的检测提供技术保障，从而为社会打击掺假造假行为提供了有效的检测手段。

参考文献：

[1]钟贤武,林虹,谈宇菲,等.欧洲“马肉事件”案例分析[J].华南预防医学,2013,39(6):51-56.

[18]冯静,刘琳,黄孟军,等.基于飞行时间质谱的快速肉类溯源检测方法[C]//第四届国际食品安全高峰论坛论文集.北京:北京食品学会,北京食品协会,2011:200-204.

[28]汪永信,安虹,程坚,等.双重实时荧光PCR法检测食品和饲料中的鸡源性成分[J].生物技术通报,2012(1):134-138.

罗建兴,刘国强,海小,郭梁.基于实时荧光PCR法定量检测食品中鸡源性成分[J].中国动物检疫,2020,37(08):110-115.

基金:内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY18370);锡林郭勒职业学院科研课题(YB-2019-03,ZD-2020-03).