皮肤衰老是不可避免的生理过程，可引起面部皮肤外观和结构发生根本变化。皮下填充剂专门修复软组织体积损失和较深的静态皱纹或褶皱[1,2]，具有操作简便、创伤小、恢复时间短、修复效果明显等优势。与只具有物理填充作用的传统皮下填充剂相比，新一代的皮下填充剂如聚左旋乳酸(Sculptra®)具有生物刺激作用，注射后首先被巨噬细胞、巨细胞等淋巴细胞包裹，在几个月内引起轻微的炎性反应，刺激人体产生新的胶原蛋白和其他结缔组织胶原，而聚左旋乳酸被逐渐降解为乳酸，最终被人体代谢为二氧化碳和水[3,4,5,6,7]。

聚左旋乳酸填充剂对较深的皱纹或褶皱如鱼尾纹、鼻唇沟和木偶线等效果明显，能维持18-25个月[8]，近年来它还被用于身体塑形[9]。还有研究结果显示，聚左旋乳酸填充剂刺激产生的新生胶原主要为Ⅰ型和Ⅲ型胶原[10,11]。Ⅰ型胶原主要存在于成人皮肤、肌腱和骨组织中，是相对较硬的胶原蛋白；Ⅲ型胶原主要存在于婴儿皮肤或血管内膜和肠道，是有弹性的胶原蛋白。随着年龄增长，Ⅰ型胶原不断增多而Ⅲ型胶原不断减少，最终Ⅲ型胶原的合成速率赶不上流失速率，导致皱纹和松弛等衰老现象，因此刺激Ⅲ型胶原的再生可有效缓解皮肤衰老。GOLDBERG等[11]评价了人体组织对Sculptra®的反应，注射后3,6个月都观察到Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的明显增加，12个月后显示正常胶原增多。

高分子微球是由高分子制备而成的粒径在1-1000μm范围内的球形粒子。不同于高分子胶束等自组装体系中粒径大小和形貌由材料的性质和自组装驱动力决定，高分子微球的粒径和形貌可通过控制制备参数进行调控，以符合不同应用的需求[12,13]。研究表明，粒径范围在20-100μm的微球不被真皮巨细胞捕获或者穿过毛细血管壁，也不会堵塞注射器针头[14]，适宜用作皮下填充剂。

有趣的是，虽然Sculptra®产品外包装上注明了聚左旋乳酸微球，但实际上聚左旋乳酸的形状是不规则的片状颗粒[15]，而这种与机体接触表面积较大又不“光滑”的形状往往会加重机体的炎性反应[16,17]。由此，作者采用与Sculptra®相同的聚左旋乳酸原料制备成高分子微球。为避免细菌等微生物对机体引起的炎性反应的干扰，采用辐照的方式对微球进行灭菌，研究了辐照条件对聚左旋乳酸分子质量和微球粒径形貌的影响；参照Sculptra®的配方将这些微球分散在含一定量羧甲基纤维素钠和甘露醇的水中，配成皮下填充剂，评价了其体外细胞毒性；以皮下注射的方式将聚左旋乳酸微球皮下填充剂植入家兔背部的皮下组织中，在不同时间点取样，通过其组织切片染色照片评价其引起炎性反应的程度和刺激胶原再生情况。

1、材料和方法

1.1 设计

材料体外表征实验与材料体内实验。

1.2 时间及地点

实验于2018年7月至2020年5月在四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心以及成都医学院科研中心动物房完成。

1.3 材料

1.3.1 主要材料与细胞

聚左旋乳酸(特性黏度[η]=3.8dL/g,Purac)；羧甲基纤维素(阿拉丁)；甘露醇(天津博迪化工)；聚乙烯醇(使用前无需纯化，山东西亚化学)；氯仿购于成都科龙试剂公司，使用前蒸馏纯化；小鼠成纤维细胞(L929)购于中科院上海细胞研究所；胰蛋白消化液(0.25%)、青霉素-链霉素(100×)、胎牛血清、DMEM高糖培养基和3(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴盐(MTT,99%)购于赛默飞世尔科技公司(Gibco)；抗兔CD68(Genetex)；抗兔Ⅰ型胶原和抗兔Ⅲ型胶原(Novus)。

1.3.2 实验动物

雌性家兔，体质量约2kg，购自成都恩斯维尔生物科技有限公司，饲养于成都医学院动物实验室，动物实验经成都医学院动物实验伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 测试与表征

聚左旋乳酸的特性黏度使用乌氏黏度计在25℃时测定，以氯仿为溶剂并根据程镕时公式计算特性黏度，见(1)式；黏均分子质量(Mv)按照Mark-Houwink经验公式，见(2)式计算。聚左旋乳酸的分子质量及其分布由凝胶渗透色谱仪(Agilent1100系列)测定，其中氯仿为流动相(1mL/min,25℃)，聚苯乙烯为标准物。高分子微球的形貌和粒径用扫描电镜(s4800，日立公司)观察。辐照灭菌在四川省原子能研究院进行，使用74×1015Bq的60Co-γ射线工业化辐射装置。

1.4.2 聚左旋乳酸微球的制备

采用乳液-溶剂挥发法制备聚左旋乳酸微球。称取100mg的聚左旋乳酸材料溶于2mL氯仿形成油相溶液(O相)，设定高速分散均质机的转速为4300r/min，在此作用下将油相缓慢滴入含有5g/L聚乙烯醇的水溶液(W相)中乳化形成水包油型(O/W相)乳液。持续乳化30min后，在磁力搅拌器作用下继续搅拌。待氯仿全部挥发后，4500r/min离心5min并弃去上清液，再用去离子水洗涤3次，加少量去离子水重新分散固体，冻干后即得微球粉末。

1.4.3 聚左旋乳酸微球皮下填充剂的制备与灭菌

参照Sculptra®的配方，将200mg聚左旋乳酸微球粉末、122mg羧甲基纤维素钠和165.8mg甘露醇，在适量去离子水中分散均匀后冷冻干燥。将冻干粉分别以25,50kGy的剂量辐照灭菌。

1.4.4 聚左旋乳酸微球皮下填充剂的体外细胞相容性

收集生长良好且处于对数生长期的L929细胞单细胞悬液，经细胞计数板计数，以特定比例加入相应培养基稀释后，加入96孔板中，每孔100μL细胞悬液，使细胞密度分别为5×103,9×103,1.2×104/孔，分别对应孵育时间72,48,24h，于细胞培养箱中静置培养过夜。待细胞贴壁后，吸除培养基，加入含不同质量浓度(50,100,250,500mg/L)皮下填充剂的培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基)，每个质量浓度设置5个平行复孔。孵育24,48和72h后，用100μL磷酸盐缓冲液洗涤，每孔加入100μL含5mg/LMTT的无血清培养基继续孵育4h。移除含MTT培养基，每孔加入100μL二甲亚砜溶解产生的甲臜，用酶联反应检测器检测每孔在490nm处的紫外吸收。

1.4.5 聚左旋乳酸微球皮下填充剂的体内生物学评价

健康雌性新西兰大白兔16只，单笼饲养。实验组取其中15只兔，背部去毛消毒，使用2mL注射器在背部相同部位皮下注射0.2mL皮下填充剂；同时设立1只背部皮下注射0.2mL生理盐水的对照组。注射后，定期观察实验兔的生长状况以及背部皮肤是否出现红斑、水肿等症状。实验组在注射后不同时间点(0.5,1.5,4,6,9个月，每个时间点3只兔)，对照组注射后第9个月，经耳缘静脉注射空气栓塞处死实验兔，揭开背部皮肤，在相应位置取皮肤和肌肉组织，立刻用组织固定液固定。经石蜡包埋后，切片进行苏木精-伊红、马松三色染色和CD68、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的免疫荧光染色。

苏木精-伊红染色：是结缔组织染色中最经典、最常用的一种染色方法，苏木精染细胞核、内质网等酸性结构，使其呈蓝色；伊红染基本结构，如细胞血浆蛋白、胶原蛋白，使其呈红色。用石蜡包埋已固定24h以上的组织样本，切片脱蜡后将其固定在载玻片上，用苏木精和伊红进行染色，最后密封好，于正置显微镜下观察记录。

马松三色染色：用于胶原纤维染色，可将胶原纤维染成绿色或蓝色。将已用石蜡包埋的组织切片，脱蜡后置于载玻片上进行马松染色，之后将玻片于正置显微镜下观察记录。

免疫荧光染色：免疫荧光染色可标记对应细胞的表面蛋白。将石蜡包埋的切片先进行脱蜡和复水处理。需要脱蜡的部分确保在二甲苯中孵育3次，每次5min；然后在乙醇稀释液中复水，使切片脱蜡。然后进行免疫荧光染色操作：先将切片与第一抗体在4℃下孵育过夜，经2次洗涤步骤后与磷酸盐缓冲液稀释的第二抗体在室温下孵育1h，洗涤2次后将切片封固、安装后，即可在倒置荧光显微镜下观察、拍照。

1.5 主要观察指标

辐照前后聚左旋乳酸微球的分子质量及形貌变化，聚左旋乳酸皮下填充剂的体内降解、炎性反应和刺激胶原再生情况。

2、结果

2.1 聚左旋乳酸微球的制备与表征

实验通过乳液-溶剂挥发法制备聚左旋乳酸微球，用扫描电镜观察了聚左旋乳酸微球的粒径和形貌，如图1A所示，聚左旋乳酸微球为圆球形，表面光滑。通过ImagePro软件对扫描电镜照片进行统计分析，聚左旋乳酸微球的粒径范围为20-90µm，该粒径范围有利于注射且不易被毛细血管壁或免疫细胞(如巨噬细胞等)捕获清除，适于后续的体内植入应用。

2.2 辐照前后聚左旋乳酸微球分子质量和形貌的变化

灭菌是保证皮下填充剂植入体内后安全性的必要措施。辐照灭菌是一种常见的灭菌方式，但高能量的γ射线会打断高分子链，进而影响微球的降解性能，因此有必要探究辐照剂量对微球分子量和形貌的影响。表1列出了聚左旋乳酸微球在辐照前后其特性黏度、黏均分子质量和数均分子质量的变化。

25kGy的辐照剂量使微球的特性黏度下降约30%，黏均分子质量和数均分子质量分别降低40%和60%;50kGy的辐照剂量使其特性黏度、黏均分子质量和数均分子质量分别下降了近75%,88%及89%。高剂量辐照可使聚左旋乳酸分子链断裂，分子质量降低显著，后面的实验均采用25kGy辐照灭菌。聚左旋乳酸微球辐照后的扫描电镜照片见图1B,C，辐照剂量并未导致微球的粒径和形貌发生明显改变，原因是聚左旋乳酸微球的降解机制为整体崩解式降解[18]，而25kGy和50kGy的辐照剂量只是破坏了高分子链中的化学键但均未达到使其崩解的临界点，故而仍保持原来的形貌而只是分子质量下降。

2.3 皮下填充剂的体外细胞毒性评价

为评价高分子微球皮下填充剂的生物相容性，通过经典的MTT法评价了不同质量浓度(以微球的浓度计)的皮下填充剂对正常细胞L929的细胞毒性。

图2显示的是皮下填充剂与L929细胞分别孵育24,48,72h后的实验结果，结果表明，在材料质量浓度低于250mg/L时细胞存活率均>90%；即使材料质量浓度高达500mg/L时细胞存活率也仍高于80%；同时，不同孵育时间的结果表明，长时间的孵育(72h)也并未产生显著的细胞毒性。根据生物材料的生物学评价标准[19]，细胞存活率大于80%可表明材料对细胞无潜在毒性。因此，聚左旋乳酸皮下填充剂的细胞相容性好、细胞毒性低。

2.4 皮下填充剂的体内生物安全性

在注射皮下填充剂后9个月的实验过程中，对照组和实验组的兔生长状态良好，体型逐渐增大，背部皮肤正常，均未发生感染，也未见发红、红斑、肿块和水肿等症状。注射后第9个月对照组兔背部组织(真皮、皮下和肌肉)切片的苏木精-伊红染色照片，见图3，图3A为真皮组织切片，可观察到明显的真皮网状层，以及不规则致密结缔组织中的胶原纤维彼此交织成致密的板层结构；图3B为皮下组织切片，由疏松结缔组织构成，可见细胞和纤维；图3C为肌肉组织横断面的苏木精-伊红染色照片，可见大小相似的圆形或卵圆形肌纤维束紧密排列，细胞核在边缘。以上组织切片结果均表明细胞形态良好，组织健康，证明聚左旋乳酸皮下填充剂在长期(9个月)植入后具有非常好的生物安全性。

2.5 聚左旋乳酸微球皮下填充剂的体内降解和炎性反应

填充剂植入不同时间后组织切片的苏木精-伊红染色和CD68免疫荧光染色照片，见图4。苏木精-伊红染色照片中可见分布在皮下疏松结缔组织中的聚左旋乳酸微球，周围被巨噬细胞等免疫细胞浸润；植入后第0.5-4个月可见微球仍保持球形，周围浸润的炎性细胞很少；而注射后第6个月微球降解程度加深，部分微球剖面呈现半圆形或不规则形状，炎性反应程度达到顶峰，可见微球被大量巨噬细胞浸润并存在多核巨细胞；植入后第9个月微球“消失”，被成纤维细胞包裹。CD68免疫荧光染色照片也呈现出随着时间的增加，微球(黑色圆洞，白色箭头)周围巨噬细胞增多(红色荧光变强)的趋势。

根据组织切片照片中材料周围浸润的巨噬细胞密度和多核巨细胞数量，与文献[15,20,21]中报道的Sculptra®引起机体的反应相比，在植入后相同或相近的时间点聚左旋乳酸微球引起的炎性程度弱于Sculptra®，而二者材料都在植入体内9个月后“消失”[22]。Sculptra®导致更强的炎性反应的原因可能是相同质量的无规则片状结构增加了与机体接触的表面积，具有更快的降解速率[17]；而且，这种不规则的片状结构的边缘往往形成较为锋利的锐角，这也会增加炎性反应程度[16]。

2.6 聚左旋乳酸皮下填充剂促进胶原再生

文献报道，聚左旋乳酸植入体内3个月后可观察到新生的胶原[6]。实验对植入后第4,6和9个月的组织切片进行马松三色染色和胶原免疫荧光染色，以评价微球刺激胶原新生的效果。

如图5所示，植入4个月后的马松三色染色照片显示，聚左旋乳酸微球周围存在较深的蓝色部分，表明新生的胶原组织；在第6个月时微球周围的蓝色部分增多，表明再生了更多胶原；第9个月时，成纤维细胞包裹形成的纤维包囊外围也可观察到胶原纤维包绕。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的免疫荧光染色照片显示，植入后第4个月时，微球周围存在新生的Ⅰ型胶原，外围则主要以Ⅲ型胶原为主；植入6个月后，微球附近的红色荧光增强而外围的绿色荧光稍有增加，说明微球附近的Ⅰ型胶原增多而外围的Ⅲ型胶原增多；植入后第9个月时，纤维包囊内部主要以Ⅰ型胶原为主而外围的Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比例接近均等。这与文献中所报道的情况相似[11]。

2.7 材料生物相容性

由体外细胞毒性实验与兔皮下注射实验可知，聚左旋乳酸皮下填充剂具有良好的生物相容性。

3、结论

该文制备了粒径范围在20-90µm的聚左旋乳酸微球，经辐照灭菌后其黏均分子质量下降了40%，但粒径和形貌未发生明显改变；参照Sculptra®配方将微球配制成皮下填充剂后，体外细胞毒性和体内安全性实验表明，其具有优良的生物相容性；在植入家兔皮下组织后，该皮下填充剂可在9个月内被机体降解吸收，能刺激机体产生更多Ⅲ型胶原，有利于延缓皮肤衰老，该皮下填充剂所引起的机体炎性反应较弱且反应进程变慢。实验结果表明，该聚左旋乳酸微球皮下填充剂可实现刺激胶原再生并具有较低的炎性反应程度，具有开发成除皱美白的医学美容产品的应用潜力。

参考文献:

[19]GB/T16886.5-2017.医疗器械生物学评价第五部分:体外细胞毒性试验[S].北京:中国标准出版社,2017.

文章来源：张译心,罗倩,梁瀚文,陈建林,赵楠,何斌.注射用聚左旋乳酸微球体内可促胶原再生[J].中国组织工程研究,2022,26(34):5448-5453.