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大鼠脱细胞肝支架的制备研究

2024-07-10 32 上传者：管理员

摘要：目的本研究旨在探索优化脱细胞肝支架的简易脱细胞方案，可为脱细胞肝的下一步应用研究提供良好的生物材料。方法依次采用0.9%氯化钠注射液500mL冲洗1h、0.5%乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸1500mL冲洗3h和1%十二烷基硫酸钠溶液3000mL冲洗大鼠肝脏6h,速度均为120滴/min,用来制备脱细胞肝支架。通过HE染色、扫描电镜和免疫荧光染色、DNA含量检测、X线下显影测试和流动性测试等方式检测脱细胞肝的结构完整性和主要成分。结果经过10h的灌流，肝脏中的血管清晰可见，HE染色中显示脱细胞肝去除了细胞核，免疫组织化学染色见胶原蛋白I、纤连蛋白和层粘连蛋白表达，扫描电镜显示支架呈疏松多孔的结构，DNA含量显示<50ng/mg, X线测试表明对注射进入的显影剂有良好的显影效果，流动性测试表明脱细胞肝保留了较为完整和通畅的血管系统。结论本研究所采用的脱细胞方法成功制备了脱细胞肝脏模型，达到了较为理想的脱细胞效果。

关键词：
肝癌
肝组织工程
肝脏
脱细胞支架
脱细胞肝
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肝癌发病率日趋增加，是危害人类生存发展的重要因素之一。其中全球肝癌新发病例和死亡人数分别为每10万人9.5例和8.7例，东亚、北非和东南亚的发病率和死亡率最高[1]。终末期肝病是一种严重危及人类的公共健康危害，而肝移植是唯一可行的补救措施。对于传统肝移植治疗存在肝源不足和长期服用免疫排斥药物等缺点，迫切需要研发一种新的治疗替代方法[2]。近年来，脱细胞肝脏支架的研究引起了广泛的关注[3],有研究将多种动物和废弃的人类肝脏进行脱细胞支架的制备，其中保存了肝脏的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),里面包含了多种细胞支持结构[4]。将原代肝细胞、内皮细胞和干细胞重新植入脱细胞支架，借助肝细胞的再生能力使得脱细胞肝脏重新恢复为新的肝脏，帮助减少免疫排斥反应和减轻肝源不足的问题[5]。

在目前的脱细胞方案中有研究[6,7]采用了蒸馏水、Triton X-100、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid, EGTA]和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)联合进行灌注，但是Triton X-100是一种有毒刺激性物质[8],对人体呼吸道和皮肤具有毒性，而且此类方法存在耗时较长，化学试剂使用较多和操作过程繁琐等弊端。基于此，本研究仅使用生理盐水、EGTA和SDS进行灌注，简化了操作步骤，降低了对操作者的健康危害，在较短的时间内完成了脱细胞肝脏的制备，优化了现有的脱细胞方案，为脱细胞肝脏的研究提供了更好的制备方法。

1、材料与方法

1.1 实验动物

20只SPF级别12周龄400g雄性SD大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，其中10只用于制备脱细胞肝脏，另外10只用于对照。饲养条件：湖北科技学院实验动物中心，给予白天12h和黑夜12h循环照射，自由饮食水，饲养温度为22℃～25℃,相对湿度为50%～60%。实验所有步骤均经湖北科技学院实验动物伦理委员会审批通过，批准文号：2024-02-002。

1.2 实验设备及材料

SZ680体式显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司);输液泵(BYS-820,长沙比杨医疗器械有限公司);乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(Macklin);十二烷基硫酸钠(Aladdin);碘克沙醇(江苏恒瑞医药股份有限公司);罗丹明-B(Aladdin);PBS缓冲液(Biosharp);一次性输液器(江西洪达医疗器械有限公司);0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司);一次性静脉输液针(武汉市王冠医疗器械有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 脱细胞肝制备

10只大鼠通过二氧化碳窒息法实行安乐死，死亡后沿腹部正中切口，暴露出肝脏。分离周围筋膜组织找到肝门静脉，将20mL PBS通过24G一次性静脉输液针从肝门静脉进行注射，使用止血钳进行固定。冲洗后取出完整肝脏，使用生理盐水溶液250mL进行肝脏表面冲洗，去除肝脏表面残留的血液，之后放入-80℃冰箱内保存。肝脏在冰箱冷冻24h后取出，室温下解冻，解冻后使用生理盐水500mL用输液泵沿门静脉进行冲洗，冲洗时间为1h。500mL生理盐水冲洗完毕后更换0.5% EGTA 1500mL冲洗3h, 再更换1%十二烷基硫酸钠3000mL冲洗6h, 冲洗速度均为120滴/min, 直至肝脏变为透明白色。

1.3.2 病理学检查

将正常肝脏和脱细胞后的肝脏在4%多聚甲醛固定24h, 组织梯度乙醇脱水，氯仿透明和采用标准石蜡包埋技术制备肝脏标本，观察细胞是否清洗干净，之后切片厚度为4μm。采用苏木精和伊红(HE)染色进行组织学分析。观察其中的细胞核和周围组织，与脱细胞后的肝脏进行对比。

1.3.3 免疫荧光检测

离体后的正常肝脏和脱细胞肝脏加入无血清冻存液后放入-80℃冰箱保存。二者采用兔多克隆抗I型胶原抗体(Abcam, ab254349)、兔多克隆抗层粘连蛋白抗体(Abcam, ab11575)和兔多克隆抗纤连蛋白抗体(Servicebio, GB13091)进行免疫荧光评价。样品用DAPI核酸(Servicebio, G1012)反染色。使用尼康Eclipse Ci-L荧光显微镜进行图像采集。

1.3.4 扫描电镜观察

使用扫描电子显微镜(SU8100)观察肝脏的形态。将正常肝脏和脱细胞后的肝脏经过2.5%戊二醛固定24h, 通过乙醇溶液脱水15～20min, -80℃下冷冻2h, 然后通过冷冻干燥24h。用10nm的铂层溅射喷涂正常肝脏和脱细胞肝脏，在3kV的加速电压下捕获扫描电镜(SEM)图像。

1.3.5 DNA含量测定

脱细胞肝脏冲洗10h后，采用真空冷冻干燥机冷冻干燥脱细胞肝脏和正常肝脏，按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA。采用Nanodrop 2000检测DNA浓度。

1.4 观察方法

1.4.1 脱细胞前后质量对比

将脱细胞后的肝脏与脱细胞之前的肝脏进行质量(g)对比。正常肝脏经过生理盐水冲洗后，去除表面水分进行称量；脱细胞肝脏灌注完毕后，去除表面水分进行称量。

1.4.2 显影性观察

使用数字化医用X射线摄影系统(DP528-B)观察脱细胞肝脏的显影性能。电压55kV,电流320.00mA,时间12.00ms, EI:57338,161.86uGy。首先，将脱细胞肝脏放到机器下进行拍摄，获得图像；再将碘克沙醇沿门静脉注射到脱细胞肝脏内，迅速放到机器下进行拍摄，获取图像。

1.4.3 流动性观察

将脱细胞后的肝脏放到SZ680体式显微镜下进行观察，调整位置和焦距。将混有罗丹明-B的纯水通过门静脉，以0.5mL/s的速度进行注射，并在1、3、5和7s时观察其进入血管的通畅性程度及血管完整性。

1.5 统计学方法

应用SPSS 26.0统计学软件分析数据，其中计量资料采用

进行表示，组间数据比较用Student's t-test检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 脱细胞肝脏的大体观

本研究采用生理盐水、0.5%EGTA溶液和1%SDS在经过长达约10h的灌注，可以观察到前期肝门静脉周围组织变白的速度较快，肝脏较为肥厚的区域变白较慢。随着时间延长，整个肝脏逐渐由红色变为黄色，直至变为透明白色，取得了血管清晰可见的脱细胞肝脏模型，结果见图1。

图1 脱细胞肝脏洗脱过程示意图

2.2 病理切片、荧光和电镜分析

通过病理染色可见，正常肝脏有着完整的细胞结构，肝细胞、肝血窦和细胞核等清晰可见，结果见图2A。脱细胞后的肝脏消除了大部分的细胞核和肝细胞，结果见图2B。免疫荧光染色显示脱细胞肝脏相比正常肝脏去除了肝细胞，保留了细胞外基质蛋白，包括胶原I型蛋白(Collagen I)、纤连蛋白(Fibronectin)和层粘连蛋白(Laminin),结果见图3A。正常肝脏的3种蛋白平均荧光面积(图3B)中Collagen I为(31.50±1.21)%、Fibronectin为(29.12±2.56)%和Laminin为(6.50±0.57)%;脱细胞后的肝脏3种蛋白平均荧光面积分别为(32.60±2.51)%、(33.12±2.06)%和(7.50±2.57)%。经过统计学分析后表明脱细胞后的肝脏蛋白含量与正常肝脏差别无异(P>0.05),表明该制备方法较好的保留了3种蛋白。扫描电镜图像表明脱细胞肝细胞外基质疏松多孔，呈蜂窝状结构，仅保留肝脏血管的形态结构，与正常肝脏紧密的细胞外基质结构形成对比，结果见图4。

图2 正常肝脏与脱细胞肝脏的H&E对比图（标尺：50μm)

图3 正常肝脏与脱细胞肝脏主要结构蛋白免疫组织化学检测结果

图4 正常肝脏与脱细胞肝脏的扫描电镜对比图

2.3 DNA含量及脱细胞前后质量分析

DNA含量显示，脱细胞前的DNA含量为(1715.38±18.07)ng/mg, 脱细胞后的DNA含量为(38.50±3.90)ng/mg, DNA含量小于50ng/mg, 达到了国际公认标准，差异具有统计学意义(P<0.01),结果见图5。脱细胞前后质量显示，脱细胞前的肝脏质量为(17.56±1.22)g, 脱细胞后的肝脏质量为(5.96±0.40)g, 差异具有统计学意义(P<0.01),结果见图6。

图5 正常肝脏和脱细胞肝脏DNA含量对比(**P<0.01,n=10)

图6 正常肝脏和脱细胞后肝脏的质量对比(**P<0.01,n=10)

2.4 显影分析

通过数字化医用X射线摄影系统的拍摄显示，注射碘克沙醇后的脱细胞肝沿门静脉通过血管网络向周围扩散，表明造影剂在脱细胞肝中具有良好的显影性，结果见图7。

图7 数字化医用X射线摄影系统拍摄的脱细胞肝脏前后对比图

2.5 流动性分析

通过SZ680体式显微镜的拍摄结果可见，混有罗丹明-B的纯水在1、3、5和7s到达了末端血管分支，表明脱细胞肝的血管具有良好的通畅性和完整性，结果见图8。

图8 SZ680体式显微镜拍摄的注射混有罗丹明-B纯水脱细胞肝不同时间的过程(×400)

3、讨论

经过长时间器官组织工程的探索，脱细胞生物工程支架的种类变得越来越多。其中脱细胞支架的成功制备表现在心脏[9]、肾脏[10]、肺脏[11]和骨[12]的组织器官研究中。

目前大部分脱细胞肝采用了肝门静脉灌注化学试剂以除去细胞成分。肝脏主要由门静脉进行供血[13],其余来自肝动脉。由于肝动脉的血管直径非常的细，所以难以灌流操作。常用的灌注试剂是Triton X-100、EGTA和SDS,但由于Triton X-100对人体具有一定的毒性，本研究便采用EGTA与SDS进行配合使用，EGTA可以用于临床医疗[14],毒性相对Triton X-100较低，且在本研究操作过程中对人体未见明显损伤。之前未见有研究仅使用EGTA和SDS进行洗脱，但经过本次研究证明，也确实得到了较为理想的脱细胞效果。

本研究将离体肝脏放在-80℃的目的是可以有效破坏细胞膜使得细胞发生裂解[15],破坏其中的细胞成分和结构，使用生理盐水冲洗的目的是去除部分细胞和残存的血液。EGTA是一种金属离子螯合剂，可以使蛋白质发生断裂，破坏细胞与ECM的黏附作用和减少残留的DNA[16,17]。但是，单独的金属离子螯合剂并不能完全去除细胞，应当与洗脱剂结合使用[18](如SDS)。SDS的作用在于溶解细胞膜、破坏细胞外基质的微观结构和减少生长因子的含量[16,19]。Triton X-100能够破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质和DNA-蛋白质的相互作用，从而破坏细胞膜和细胞核的结构。Triton X-100与SDS同属于表面活性剂，而且作用类似，可替换使用，但与Triton X-100相比，SDS的去细胞核效率更高[20]。在以往的实验方案[21,22]中，SDS浓度通常为1%～4%,EGTA浓度为0.02%～0.2%,Triton X-100浓度为2%～4%,本研究尝试采用了较高浓度的EGTA和1%SDS,简略了操作步骤，相应缩短了灌流时间。采用输液泵、生理盐水、0.5%EGTA和1%SDS进行灌注的研究优势在于：①输液泵可以精细调节流速，防止流速过快导致肝脏血管损伤和肝脏破裂；②取材方便，输液泵和生理盐水是临床常用的医疗设备和液体，与之配套的一次性24G静脉输液针可以轻松插入大鼠门静脉，帮助临床医生进一步研究脱细胞肝的使用价值；③操作简易性，有研究[23,24]将导管插入门静脉和胆管，二者同时进行灌流，而本研究尝试只将输液针插入门静脉进行灌流，灌流的液体通过肝门静脉出入，灌流完成后未发现肝脏破损，使用了相对较少的化学试剂，便于开展基础性的研究；④采用相对较高浓度SDS和EGTA可缩短灌流时间，避免长时间灌流导致肝脏膨胀破损，损坏其完整性。目前，脱细胞的程度主要由残留DNA决定，一般公认的脱细胞标准[25]如下：①双链DNA含量<50ng/mg; ②DNA片段长度<200碱基对；③DAPI或HE染色缺乏可见的核含量。本研究脱细胞后的DNA含量为(38.50±3.90)ng/mg, 低于标准所规定的50ng/mg。而且DAPI和HE染色中未见有细胞核，达到了国际上所公认的标准。免疫组化染色中，脱细胞肝支架中保留了胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。脱细胞后的三种蛋白质的荧光面积与正常肝脏相比无明显差异性，表示本研究较好的保留了三种蛋白，尽可能保存了细胞外基质的完整性。

扫描电镜提示本实验脱细胞肝细胞外基质疏松多孔，血管口径清晰可见，与正常肝脏细胞外基质致密的结构形成了鲜明对比。脱细胞肝可在数字化医用X射线摄影系统下观察液体显影的能力，测试栓塞剂的显影效果。SZ680体式显微镜下拍摄的注射罗丹明-B纯水过程，这是为了验证脱细胞肝血管的完整性和液体在其中是否具有良好的流动性。理想的是，经过本研究证实了脱细胞肝血管保存完整以及显影程度良好，是液体栓塞剂用于体外验证性能的良好生物材料。

随着组织工程技术的进步，脱细胞方案的不断创新与发展，脱细胞肝脏的研究取得了巨大的进展。但值得注意的是，安全的脱细胞方案、更方便快捷的制备方式和尚未发掘的利用价值依然是脱细胞肝脏发展的重点。本研究发现，采用输液泵、生理盐水、EGTA和SDS进行灌注制备的大鼠脱细胞肝脏，支架无细胞成分、DNA含量低、血管网络清晰可见，为肝脏脱细胞的研究贡献了理想的脱细胞支架材料。与传统方法相比，该制备过程相对安全、操作简易和灌注时间较短。

综上所述，本次研究优化了脱细胞肝脏的制备方法，为以后脱细胞肝脏的发展奠定了一定的基础。

参考文献:

[22]杨加敏,胥义,党航宇,等.组织器官脱细胞支架的制备及研究进展[J].生物工程学报,2022,38(6):2169

基金资助:湖北省自然科学基金面上项目(2023AFB538,2022CFB755); 国家自然科学基金青年项目(82003308,52303182); 湖北科技学院博士启动基金(BK202118);湖北科技学院科研创新团队项目(2023T10);

文章来源:陈宁,郭安然,刘安娜,等.大鼠脱细胞肝支架的制备研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(04):313-318.