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水疱性口炎病毒运用不同细胞培养的效果对比

2020-06-18 1412 上传者：管理员

摘要：目的比较鸡胚成纤维细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和人羊膜细胞(WISH细胞)培养水疱性口炎病毒(VSV)的效果。方法将VSV分别按250、300、350TCID50/0.1mL感染鸡胚成纤维细胞、Vero细胞和WISH细胞,比较3种细胞培养的VSV的滴度及液氮中保存3、6、12个月的稳定性。结果鸡胚成纤维细胞、Vero细胞和WISH细胞培养的VSV的滴度分别为(106.21±100.07)、(105.21±100.07)和(104.88±100.12TCID50/0.1mL。用鸡胚成纤维细胞培养的VSV放置12个月稳定性较高,而用Vero细胞和WISH细胞培养的VSV稳定性较低,滴度分别为(105.75±100.12、(104.08±100.07)和(103.62±100.12TCID50/0.1mL。结论使用鸡胚成纤维细胞培养的VSV具有较高的滴度和稳定性,是实验室培养VSV的首选方法。

关键词：
单股负链RNA病毒
水疱性口炎病毒
滴度
病毒培养
病毒性疾病
稳定性
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水疱性口炎病毒（VSV）是一种单股负链RNA病毒，属于弹状病毒科，水疱病毒属，细胞感染VSV后，可迅速出现明显的细胞病变，如圆缩、脱落。VSV引起水疱性口炎，是牛、马、猪和野生脊椎动物的一种病毒性疾病，主要表现为口、蹄和乳头周围的水疱样损害，人也可被感染患病，出现类似流感的症状[1,2,3,4]。《中国药典》三部（2015版）通则“干扰素生物学活性测定法”第一法为细胞病变抑制法，使用人羊膜细胞（WISH细胞）和VSV测定干扰素的生物学活性，原理是干扰素可以保护WISH细胞免受VSV的破坏作用，根据干扰素对WISH细胞的保护效应曲线计算干扰素的生物学活性[5]，该方法需要定期培养制备VSV，并且对VSV的滴度、稳定性有较高的要求。干扰素生物学活性测定实验室制备VSV时，常使用鸡胚成纤维细胞、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和WISH细胞进行病毒培养[6]。

为考察这3种细胞培养VSV的效果，本研究将从病毒滴度、病毒稳定性方面对这3种细胞培养的VSV进行比较。

1、材料与方法

1.1细胞、病毒及鸡胚

WISH细胞、Vero细胞均购自美国模式培养物集存库；VSV为本院重组药物室保存；9日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2主要试剂及仪器

MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）、消化液（0.25%胰酶-EDTA）购自美国Lifetechnologies公司；酶标仪购自美国MD公司。

1.3鸡胚成纤维细胞培养VSV

将鸡胚依次用碘酊和75%乙醇消毒气室部卵壳，镊子去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，取出鸡胚置平皿中，剪去头、四肢、内脏及骨骼，用Hank’s液冲洗2次，充分剪碎，使其近于乳糜状，移入50mL离心管中，Hank’s液吹洗，静置沉淀后弃上层液体，重复2次；加入5倍体积消化液，吹打均匀后37℃水浴消化20～30min；弃上层液体，用含10%FBSMEM培养基冲洗，600r/min离心1min，弃上层液体，重复2次；沉淀中加入含10%FBS的MEM培养基，吹打均匀，8层纱布过滤，取滤液，以6.0×105个/mL的密度接种至75cm2培养瓶中，每瓶20mL,37℃，5%CO2条件下培养约15h，至细胞长成致密单层；弃培养液，将VSV用MEM培养基稀释至250TCID50/0.1mL后，每瓶加入10mL,37℃，5%CO2条件下孵育1h；补加含10%FBS的MEM培养基5mL，继续培养约24h，使90%以上细胞圆缩、脱落、破碎；将培养瓶置-80℃冰箱中过夜；室温解冻，充分吹打，重复2次，分装（0.5mL/支）后置液氮保存。

1.4Vero细胞培养VSV

取生长状态良好的Vero细胞，消化后用含10%FBS的DMEM培养基调整至3.5×105个/mL，接种至75cm2培养瓶中，每瓶20mL,37℃，5%CO2条件下培养约24h，至细胞长成致密单层；弃培养液，将VSV用DMEM培养基稀释至300TCID50/0.1mL，每瓶加入10mL,37℃，5%CO2条件下孵育1h；补加含10%FBS的DMEM培养基5mL,37℃，5%CO2条件下培养约30h，使90%以上细胞圆缩、脱落、破碎；将培养瓶置-80℃冰箱中过夜；室温解冻，充分吹打，重复2次，分装（0.5mL/支）后置液氮保存。

1.5WISH细胞培养VSV

取生长状态良好的WISH细胞，消化后用含10%FBS的MEM培养基调整至3.0×105个/mL，接种至75cm2培养瓶中，每瓶20mL,37℃，5%CO2条件下培养约24h，至细胞长成致密单层；弃培养液，将VSV用MEM培养基稀释至350TCID50/0.1mL，每瓶加入10mL,37℃，5%CO2条件下孵育1h；补加含10%FBS的MEM培养基5mL,37℃，5%CO2条件下培养约30h，使90%以上细胞圆缩、脱落、破碎；将培养瓶置-80℃冰箱中过夜；室温解冻，充分吹打，重复2次，分装（0.5mL/支）后置液氮保存。

1.6VSV滴度测定

取生长状态良好的WISH细胞，消化后用含10%FBS的MEM培养基调整至3.0×105个/mL，接种至96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃，5%CO2条件下培养24h。在96孔板中将制备的VSV用含3%FBS的MEM培养基进行10倍系列稀释（10-1～10-10），每个稀释度设8个复孔。将接种WISH细胞的培养板中的培养液弃去，加入系列稀释的VSV,100μL/孔，同时设不加VSV的细胞对照，37℃，5%CO2条件下培养24h，显微镜下观察细胞病变。用Karber法按下式[7,8,9]计算VSV滴度。试验重复3次，结果计算RSD。

病毒滴度（lgTCID50)=L-D(S-0.5)

式中L为VSV最高稀释度的对数，D为稀释度对数之间的差，S为病变阳性孔比率总和。

1.7VSV稳定性检测

将用3种细胞培养的VSV分装后至液氮保存，于第3、6、12个月测定VSV滴度，根据滴度变化比较不同细胞培养VSV的稳定性。

2、结果

2.1不同细胞培养VSV的滴度

结果显示，使用鸡胚成纤维细胞培养的VSV滴度最高，Vero细胞次之，WISH细胞最低，最高滴度与最低滴度相差约20倍，见表1。

表1使用3种细胞培养VSV的滴度

2.2不同细胞培养VSV的稳定性

结果显示，鸡胚成纤维细胞、Vero细胞及WISH细胞培养的VSV保存12个月后，滴度分别降低了约3、13和18倍，鸡胚成纤维细胞培养的VSV稳定性最高，见表2。

表2使用3种细胞培养VSV在不同保存时间的滴度

3、讨论

病毒的培养，通常使用原代细胞、传代细胞、人二倍体细胞进行。原代细胞的优点是敏感性好，包括鸡胚成纤维细胞、猴肾细胞、鼠肾细胞等，其中猴肾细胞、鼠肾细胞等制备困难，主要用于疫苗的生产，而鸡胚成纤维细胞制备简单，广泛用于各种病毒的培养[10,11]。传代细胞的优点是可以多次传代，操作简单，包括Vero细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞、WISH细胞等，其中Vero细胞由于不能表达干扰素蛋白，对于病毒具有广谱易感性，是最常用的疫苗生产用细胞基质[12,13]。人二倍体细胞的优点是无致瘤型，与人抗原性一致，包括2BS株、MRC-5株、KMB17株等，一般用于疫苗的生产[14]。

由于鸡胚成纤维细胞、Vero细胞和WISH细胞具有较好的病毒敏感性，且比较容易获得，因此大多数实验室使用这3种细胞培养VSV。本研究对这3种细胞培养VSV的效果进行了比较。在比较之前，本研究组已经分别对每种细胞的VSV培养方法进行了优化，包括细胞接种密度、培养时间、病毒接种量、收获时间等，保证每种细胞均可获得最高的病毒产量。其中VSV接种量是一个关键参数，当病毒接种量过低时，细胞不能完全感染，获得的病毒滴度较低；当病毒接种量过高时，可产生大量的缺陷干扰颗粒（de-fectiveinterferingparticle,DIP）。DIP是一种较正常VSV小的不完全的病毒体，缺少转录酶活性，感染细胞后不能单独增殖，必须依赖野生株才能增殖，DIP与野生株一起增殖时，会竞争性地抑制后者。另外，DIP还可导致细胞处于持续感染状态，对野生病毒攻击有抵抗力，从而使培养的病毒滴度显著下降[15,16]。经过优化，在接种体积相同的条件下，鸡胚成纤维细胞、Vero细胞和WISH细胞的VSV接种滴度分别确定为250、300和350TCID50/0.1mL。

本研究结果显示，与WISH细胞和Vero细胞相比，使用鸡胚成纤维细胞培养的VSV具有较高的滴度，可能与其对VSV的敏感性较高有关。鸡胚成纤维细胞培养的VSV还具有较高的稳定性，可以使用较长时间，在使用期间，重新标定病毒滴度的次数也可减少。因此，使用鸡胚成纤维细胞进行培养是干扰素生物学活性测定实验室制备VSV的首选方法。

参考文献：

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:通则132-133.

[6]张琳,袁波,张利.鸡胚细胞扩增VSV病毒及毒力稳定性的考察[J].黑龙江医药,2003,16(2):122-123.

裴德宁,史新昌,秦玺,陶磊,饶春明.不同细胞培养水疱性口炎病毒的效果比较[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):626-628.

基金:“十三五”重大新药专项,创新生物技术药评价及标准化关键技术研究(2018ZX09101001).