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龟板通过抑制炎症反应改善小鼠软骨终板退变

2023-07-12 154 上传者：管理员

摘要：探究龟板是否能够通过抑制炎症反应改善自然衰老小鼠的软骨终板退变。方法以3月龄小鼠作为年轻对照组，采用自然衰老模型，选取24月龄的小鼠12只，随机分为老年组与龟板组，每组6只。采用苏木素伊红染色及番红O-固绿染色实验明确自然衰老小鼠是否发生软骨终板退变；免疫组化检测IL-1β在各组小鼠软骨终板组织中的表达情况；免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白在各组小鼠软骨终板组织中的表达情况。结果与年轻对照组相比，老年组小鼠的HE染色表明其出现较为严重的软骨终板组织退变；与老年组相比，龟板组有一定程度的改善。番红O-固绿染色实验表明，与年轻对照组相比，老年组小鼠的软骨终板组织含水量减少；与老年组相比，龟板组小鼠的软骨终板组织胶原含量及含水量增加。组织免疫组化结果表明，老年组小鼠的软骨终板组织中IL-1β表达增加，药物干预后，龟板组小鼠的软骨终板组织中IL-1β表达减少。组织免疫荧光表明，与年轻对照组相比，老年组出现了明显的Ⅱ型胶原蛋白降解；药物干预后，龟板组有效地减少了Ⅱ型胶原蛋白的降解。结论龟板可以通过抑制IL-1β减轻炎症，减少Ⅱ型胶原蛋白降解，从而改善自然衰老小鼠的软骨终板退变。

关键词：
小鼠
炎症微环境
自然衰老
软骨终板
龟板
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软骨终板是椎间盘与相邻椎体之间的界面，有助于吸收负荷和缓解冲击。随着年龄增长，软骨终板会发生退行性变化，例如变薄、爆裂和钙化，甚至移行为骨性终板[1]。这些变化会导致软骨终板生物力学性能下降和椎间盘的营养供给减少，从而导致整体椎间盘退变加重[2,3]。因此，在椎间盘退变的治疗中，重视软骨终板的健康对于减轻因脊柱退变引起的疼痛、改善脊柱功能、延缓疾病进展具有重要意义。

软骨终板退变与炎症之间存在复杂的关系。软骨终板退变会引起炎症反应，退变时释放炎症因子，触发免疫反应并引起炎症[4]。慢性炎症又会持续释放炎性因子引起疼痛，并进一步促进软骨终板退变[5,6]。研究表明，通过抗感染治疗可以在一定程度上延缓终板退变的进程[5,7]。笔者前期研究表明，中药龟板具有抗炎作用[8,9],因此本研究采用自然衰老小鼠的终板退变模型，验证龟板与炎症的关系以及在延缓软骨终板退变中的作用。

1、材料与方法

1.1实验动物与主要试剂

C57BL/6小鼠(3月龄、24月龄)从广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0034]购买，饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物房[SYXK(粤)2018-0092]。龟板购于广州中医药大学第一附属医院。苏木素伊红染色试剂盒(Beyotime,货号C0105M)、番红O-固绿软骨染色试剂盒(Solarbio,货号G1371)、IL-1β抗体(Affinity,货号AF4006)、Ⅱ型胶原蛋白抗体(Proteintech,货号28459-1-AP)、免疫组化二步法试剂盒(北京中杉金桥公司，货号PV6001)。

1.2方法

1.2.1龟板水提液制备：

取100 g龟板饮片，加入适量纯水后浸泡过夜(浸泡时间不少于6 h),后文火煎煮2 h,煎煮至50 mL(即该水提液生药浓度为2 g/mL)。

1.2.2实验分组及方案：

本实验分为3组，每组6只。取3月龄小鼠为年轻对照组；24月龄小鼠12只，随机分成老年组和龟板组；龟板组每日给予龟板水提液灌胃，每日2次，每次0.2 mL/10 g,连续给药8周；老年组给予等量的PBS灌胃。

1.2.3椎间盘组织取样及处理：

给药完成后进行取材。处死后，剥离小鼠L4-L5椎间盘组织，PBS清洗后放置于4%多聚甲醛中固定；随后进行包埋固定及切片处理。

1.2.4组织病理染色：

取部分椎间盘组织切片脱蜡、水化处理，分别根据说明书进行苏木素伊红染色(hematoxylin eosin, HE)染色、番红O-固绿染色实验。使用组织切片扫描仪对实验结果进行观察。

1.2.5免疫组化/免疫荧光：

取部分椎间盘组织切片脱蜡、水化处理，PBS冲洗；随后进行热修复，PBS冲洗；3% H202浸泡10 min;根据说明书配比一抗(Ⅱ型胶原蛋白),4℃孵育过夜；其余步骤根据免疫组化二步法试剂盒说明书进行。使用DAB显色3 min,充分水洗；苏木素染色；脱水、中性树脂封片。免疫荧光检测方法一抗孵育前步骤同免疫组化，一抗孵育后回收一抗，PBS充分洗涤；用带有荧光标记的二抗在常温、避光下孵育60 min;二抗孵育结束后使用PBS充分洗涤，水分沥干，用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片。

2、结果

2.1椎间盘病理染色

实验过程中没有小鼠死亡。椎间盘组织学染色表明，HE染色及番红O-固绿染色可以观察到年轻小鼠组椎间盘内的软骨终板结构、形态基本正常，而老龄小鼠组的终板发生相对较为严重的骨化，细胞数目减少，终板与髓核的边界结构异常，软骨终板细胞外基质的严重流失及裂隙的形成。通过番红O-固绿染色可观察到老龄小鼠组退变终板的软骨终板较年轻小鼠组的软骨终板活性降低，胶原蛋白含量减少，含水量减少。而龟板干预后的老龄小鼠软骨终板在结构、形态上相对于未干预的老龄小鼠而言更加完整，细胞数量较多，且细胞形态较为一致。HE染色可观察到，龟板干预后老龄小鼠软骨终板仍保持较好的组织结构，通透性较高，与髓核的边界较为清晰。未干预的老龄小鼠软骨终板出现细胞融合，有骨化趋势，通透性降低，且终板出现裂隙，质地粗糙不均。软骨终板与髓核的边界不清晰。番红O-固绿染色可观察到经龟板干预的老龄小鼠组软骨终板组织含水量较多，而未用龟板干预的老龄小鼠则与之相反(图1)。

图1 HE和番红O-固绿染色检测软骨终板结构与胶原含量变化

2.2 IL-1β在老龄小鼠椎间盘中的表达

免疫组化结果显示，年轻小鼠组椎间盘软骨终板透亮均匀，炎症因子IL-1β的阳性表达量较少，而老龄小鼠组椎间盘软骨终板炎症因子IL-1β的阳性表达量较多。IL-1β表达得越多，表明终板的炎症反应越剧烈。经龟板干预的老龄小鼠软骨终板透亮度更高，炎症因子IL-1β的阳性表达量较少，而未干预的老龄小鼠组软骨终板质地粗糙不均，其炎症因子IL-1β的阳性表达量较多(图2)。

图2免疫组化检测软骨终板中IL-1β的表达情况

2.3老龄小鼠中Ⅱ型胶原蛋白的表达

组织免疫荧光结果显示，年轻小鼠软骨终板细胞外周Ⅱ型胶原蛋白的阳性表达量较多，而老龄小鼠组软骨终板细胞外周Ⅱ型胶原蛋白荧光强度显著降低，表达量较少。年轻小鼠的软骨终板细胞分泌合成的细胞外基质较多，而细胞外基质主要由富含水分的蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白组成。经龟板干预后的老龄小鼠组软骨终板的Ⅱ型胶原蛋白仍有一定程度的阳性表达，而未干预的老龄小鼠的软骨终板Ⅱ型胶原蛋白几乎未见阳性表达(图3)。

图3免疫荧光染色检测软骨终板中Ⅱ型胶原蛋白表达情况

3、讨论

椎间盘由髓核、纤维环及软骨终板组成。软骨终板是一层薄而透明的软骨，覆盖在椎间盘的顶面和底面，为椎间盘提供营养支持并有助于分散传递给椎间盘的压缩应力[10]。研究表明，软骨终板退变钙化，刚度增加，会提高对椎间盘压力，诱发整体椎间盘发生退变[1]。在退变过程中，终板会发生结构变化，包括厚度降低和软骨细胞数量减少，为椎间盘供给的营养减少，增加椎间盘发生退行性变化的风险[3,11,12,13]。本研究结果表明，老龄小鼠终板会出现骨化、结构改变、表明磨损等情况，使软骨终板的功能丢失。同时椎间盘结构也发生改变，使软骨终板与椎间盘之间的界限逐渐消失，进一步表明老龄小鼠椎间盘与软骨终板均出现退变。

软骨终板退变后可能会被血管和神经纤维浸润，导致疼痛和其他与椎间盘退变相关症状的发展[14]。终板也可能破裂或碎裂，进一步损害其功能并导致椎间盘进一步退化[15]。本实验研究中发现，老龄组小鼠的椎间盘HE染色显示终板组织形态结构紊乱、间隙增大、厚度减少、与髓核边界不清晰等改变；番红O-固绿染色实验显示，老龄组小鼠的终板组织含水量减少及形态结构发生改变。因此，研究软骨终板和椎间盘退变之间的关系对于研究椎间盘退变的有效治疗方法非常重要。

IL-1β是一种促炎症细胞因子，已被证明在软骨终板退化过程中起作用[4,16]。研究表明，IL-1β可刺激基质金属蛋白酶的产生，导致软骨终板内细胞外基质被分解，直接导致了终板形态的变化，改变软骨终板的机械性能[17,18]。这与本研究结果一致，年轻小鼠椎间盘与软骨终板中IL-1β表达较低，而老龄小鼠软骨终板发现IL-1β高表达，表明软骨终板退变伴随着炎症环境。研究发现，抑制IL-1β可在一定程度上改善椎间盘与软骨终板退变，这表明抑制终板组织内炎症因子能有效改善软骨终板退变[6,19]。

Ⅱ型胶原蛋白是软骨的主要成分，在维持其结构和功能方面起着关键作用[20]。Ⅱ型胶原蛋白提供了机械支持，有助于抵抗运动时产生的椎间盘压缩和剪切力[2,21]。研究表明，退变的软骨终板组织中Ⅱ型胶原蛋白表达量显著减少[22]。随着Ⅱ型胶原蛋白水平的下降，软骨终板变得更容易发生退行性变化，导致蛋白多糖和细胞外基质的其他关键成分的损失[23,24]。本研究结果也发现，年轻小鼠组软骨终板有丰富的Ⅱ型胶原蛋白表达，而老龄小鼠组软骨终板中Ⅱ型胶原几乎不表达，表明年龄增加后软骨终板Ⅱ型胶原蛋白丢失，这可能导致软骨终板渗透性改变，营养物质难以分泌到椎间盘内[3,25]。且终板退变后细胞数量减少，形态改变，更容易受到IL-1β诱发炎症的影响，进一步加剧退变进程。

补肾中药龟板常被用于治疗腰痛。前期研究发现，龟板具有抗炎和镇痛作用[8,9]。因此龟板通过减少炎症可能在一定程度上延缓软骨终板退变。而在本实验研究中，与老龄小鼠组相比，龟板干预组免疫组织染色中，HE染色、番红O-固绿染色实验显示终板组织结构比较完整，局部软骨组织较规则，厚度较均匀，软骨组织含水量较多，退变程度较轻。免疫组化结果表明，龟板干预后终板组织中炎症因子IL-1β表达水平下降。此外，组织切片免疫荧光显示，与自然衰老小鼠相比，龟板干预后Ⅱ型胶原蛋白的降解减少。因此，本研究表明龟板可抑制炎症因子表达，有效减少Ⅱ型胶原蛋白降解，延缓软骨终板退化。

综上所述，本研究探讨了龟板对衰老小鼠软骨终板退变的预防作用，丰富了中医药防治脊柱退变性疾病的理论内涵，为临床上防治脊柱退变性疾病提供了实验依据。但本研究存在一些不足：本研究对龟板改善软骨终板退变的机制研究不够深入，未对软骨终板具体退变机制及龟板的干预效果进行深入评估，下一步将针对上述问题进一步探讨。

基金资助:国家自然科学基金(82274615);广东省教育厅创新团队项目(2021KCXTD017);

文章来源:何嘉辉,甘延池,龚焱等.龟板通过抑制炎症反应改善小鼠软骨终板退变[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(07):949-952+959.