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百事乐加味方对卒中后抑郁大鼠小胶质细胞焦亡的影响

2023-07-21 54 上传者：管理员

摘要：探讨百事乐加味方对卒中后抑郁(PSD)大鼠海马区小胶质细胞焦亡的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组(PSD模型)、阳性对照组(灌胃给药0.54×102 g•kg-1氟西汀+0.027 g•kg-1阿司匹林)、实验组(灌胃给药23.5 g•kg-1百事乐加味方)。用旷场实验、Morris水迷宫实验进行抑郁样行为学检测；用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)水平；用免疫荧光双标法检测海马区小胶质细胞标志物离子钙接头蛋白1(Iba-1)与Nod样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白共表达情况；用蛋白质印迹法检测海马组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达情况。结果假手术组、模型组、阳性对照组和实验组爬格次数分别为(57.60±10.55)、(33.00±10.37)、(53.00±13.05)和(53.00±19.46)次；目标象限停留时间分别为(50.15±4.75)、(38.70±3.32)、(49.31±2.78)和(47.00±7.71)s;血清中IL-1β含量分别为(117.86±8.45)、(145.35±14.36)、(122.08±10.30)和(123.65±9.53)pg•mL-1;NLRP3/Iba-1蛋白表达分别为20.93±0.53、65.27±0.61、33.37±0.44和43.43±0.40;Caspase-1/Iba-1蛋白表达水平分别为17.51±0.19、60.38±1.05、26.64±0.35和29.62±0.95;海马组织中NLRP3蛋白相对表达水平分别为0.38±0.04、0.95±0.08、0.49±0.03和0.55±0.06;Caspase-1蛋白相对表达水平分别为0.35±0.01、0.88±0.04、0.52±0.01和0.68±0.04。模型组上述指标与假手术组比较，实验组上述指标与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论百事乐加味方可以抑制PSD大鼠海马区小胶质细胞焦亡，减轻炎症反应，其机制可能与调控NLRP3/Caspase-1信号通路有关。

关键词：
Nod样受体蛋白3/胱天蛋白酶-1
小胶质细胞焦亡
情感障碍
百事乐加味方
脑卒中后抑郁
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卒中后抑郁(post-stroke depression, PSD)是脑卒中后伴有情感障碍的综合征，炎症反应是其发生发展的重要环节[1]。小胶质细胞是脑缺血后炎症反应的主要效应细胞[2]。细胞焦亡是加重缺血性脑损伤的重要因素，抑制细胞焦亡可能减轻缺血性脑损伤[3];Nod样受体家族3(Nod-like receptors, NLRP3)介导的细胞焦亡可扩大炎症反应，在抑郁症的发展中起关键作用[4]。本课题组对PSD的发病机制进行了系列研究，发现自拟百事乐加味方可改善PSD大鼠的抑郁样行为，减轻炎症反应[5,6]。本实验通过NLRP3介导的细胞焦亡通路探讨百事乐加味方防治PSD的可能作用机制，为PSD的临床治疗提供新的实验依据。

一、材料与方法

1、材料

动物SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理批号：ZYFY20210819-04)。

药品与试剂百事乐加味方由姜黄、贯叶连翘、人参、生黄芪、川芎等中药组成，由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供；盐酸氟西汀，规格：每粒20 mg,批号：21257A,注册证号：国药准字HJ20181215,法国Patheon France生产；阿司匹林肠溶片，规格：每片100 mg,批号：BJ63084,注册证号：国药准字HJ20160684,德国Bayer公司生产。白细胞介素-1β(interleukin-1,IL-1β)、IL-18酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自武汉Bioswamp公司；NLRP3抗体，购自武汉Boster公司；离子钙接头蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba-1)抗体、胱天蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific protease-1, caspase-1)抗体，均购自湖南艾方生物科技有限公司；消皮素D(gasdermin D, GSDMD)抗体，购自美国Affinity公司；肌动蛋白(β-actin),购自美国Immunoway公司。

仪器Enspire多功能酶标仪，美国Perkinelmer公司产品；FluorChem R多功能成像分析系统，美国ProteinSimple公司产品；CheemiDoc XRS+Imager蛋白印记系统，美国Bio-Rad公司产品。

2、实验方法

2.1模型与处置

麻醉大鼠，用线栓阻塞右侧颈内动脉(假手术组栓线不插入颈总动脉),制备卒中大鼠模型[7]。术后24 h按Longa评分法[8]进行神经功能缺损评分，选择评分≥1分且<4分的大鼠，恢复7 d后，单笼孤养。用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)法制备抑郁大鼠模型[9,10],包括禁食禁水24 h、潮湿垫料24 h、4℃冰水游泳3 min、倾笼24 h、噪音4 h、夹尾3 min、昼夜颠倒24 h共7种刺激方法。每天随机选取1种刺激，且相同刺激不连续出现，持续刺激5周。

2.2实验分组及给药

将大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、阳性对照组和实验组。各组大鼠均从CUMS造模第1天开始给药，假手术组、模型组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃给药0.54×10-2 g·kg-1氟西汀+0.027 g·kg-1阿司匹林，实验组灌胃给药23.5 g·kg-1百事乐加味方，各组灌胃体积均为10 mL·kg-1,每天灌胃1次，连续35 d。

2.3行为学检测

旷场实验[11]黑色敞箱底面等分成25个正方形，将大鼠放入黑色敞箱底部中心，适应1 min后，记录3 min内大鼠的活动情况，并记录爬格次数和直立次数。实验结束后通过录像分析软件统计结果。

Morris水迷宫实验[12]12] Morris水迷宫被等分为4个象限，内盛自来水(24±1)℃。连续4 d将大鼠从不同象限放入水池中，观察并计时90 s,记录大鼠寻找并爬上平台的时间，若90 s内未找到平台，则引导其至平台，实验过程中平台的位置始终保持不变。第5天，撤去平台，给药1 h后，在平台对侧象限将大鼠面向池壁放入水中，录像并记录大鼠3 min内在平台象限活动时间及穿越平台次数。

2.4用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-18含量[13]13]

麻醉大鼠，腹主动脉采集血液5 mL,置于采血管中，以3 500 r·min-1离心10 min后取上清液。样品保存-80℃冰箱中。按照大鼠ELISA试剂盒说明书要求测定IL-1β、IL-18含量。

2.5用免疫荧光双标检测海马组织NLRP3/Iba-1、Caspase-1/Iba-1蛋白表达情况[14]14]

取大鼠全脑组织，4%多聚甲醛溶液固定48 h,冠状切取脑组织，包埋制成蜡块，制作厚度为5μm的石蜡切片，进行抗原修复，封闭，分别滴加Iba-1(1∶300)和NLRP3(1∶100)、Iba-1(1∶300)和Caspase-1(1∶100),4℃孵育过夜，加入荧光二抗(1∶300),避光室温孵育1 h, DAPI染核，抗荧光淬灭剂封片；于激光共聚焦显微镜下观察，检测其荧光强度。

2.6用蛋白质印迹法检测海马组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平[15]15]

取海马组织，组织裂解液裂解后，离心取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。依次对蛋白进行变性、凝胶电泳、湿式转膜，脱脂牛奶室温封闭1 h,加入一抗，4℃过夜，缓冲液洗涤；加入二抗，室温孵育1 h;显影、曝光，凝胶成像系统拍照，用Image J软件对条带进行分析，计算NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白与内参蛋白β-actin灰度值的比值作为各目的蛋白的相对表达水平。

3、统计学方法

用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以x¯±s表示，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1行为学检测结果

1.1旷场实验结果

将大鼠按体质量随机分为假手术组(未插入线栓)、模型组(卒中后抑郁模型)、阳性对照组(0.54×10-2 g·kg-1氟西汀+0.027 g·kg-1阿司匹林)和实验组(23.5 g·kg-1百事乐加味方)。假手术组、模型组、阳性对照组和实验组大鼠爬格次数分别为(57.60±10.55)、(33.00±10.37)、(53.00±13.05)和(53.00±19.46)次；直立次数分别为(9.80±3.70)、(2.88±1.64)、(7.17±2.04)和(6.00±2.45)次。模型组与假手术组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01);实验组与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。实验轨迹图见图1。

图1各组大鼠旷场实验轨迹图

图2各组大鼠Morris水迷宫实验轨迹图

1.2 Morris水迷宫实验结果

假手术组、模型组、阳性对照组和实验组大鼠穿越平台次数分别为(4.33±1.03)、(1.17±0.98)、(3.00±1.55)和(3.17±1.60)次；目标象限停留时间分别为(50.15±4.75)、(38.70±3.32)、(49.31±2.78)和(47.00±7.71) s。模型组与假手术组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01);实验组与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。实验轨迹图见图2。

2对PSD大鼠血清中IL-1β、IL-18表达的影响

模型组与假手术组比较，血清IL-1β、IL-18含量均明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05);实验组与模型组比较，血清IL-1β、IL-18含量均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),见表1。

表1各组大鼠血清IL-1β、IL-18水平比较(x¯±s)

3对PSD大鼠海马区NLRP3/Iba-1、Caspase-1/Iba-1阳性表达的影响

模型组与假手术组比较，海马区小胶质细胞中NLRP3、Caspase-1阳性表达均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01);实验组与模型组比较，海马区小胶质细胞中NLRP3、Caspase-1阳性表达均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01),见表2。

表2各组大鼠海马组织NLRP3/Iba-1、Caspase-1/Iba-1荧光强度比较(x¯±s)

4对PSD大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达的影响

模型组与假手术组比较，海马组织中的NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01);实验组与模型组比较，海马组织中的NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01),见表3。

表3各组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达比较(x¯±s)

三、讨论

百事乐加味方由姜黄、人参、生黄芪、川芎等中药组成。研究发现，姜黄素通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路，减少IL-1β、IL-18的释放，改善神经功能[16]。人参皂苷化合物K通过抑制NLRP3炎症小体活化，抑制IL-1β、IL-18炎性细胞因子的释放，发挥抗抑郁作用[17]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-18明显升高，海马区NLRP3/Iba-1、Caspase-1/Iba-1阳性表达升高，海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平升高，经百事乐加味方干预后均降低，表明百事乐加味方对NLRP3/Caspase-1信号通路具有抑制作用。

百事乐加味方通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路，降低焦亡标志蛋白GSDMD表达，减少促炎因子IL-1β、IL-18释放，抑制小胶质细胞焦亡，改善PSD大鼠抑郁样行为。

参考文献:

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基金资助:湖南省自然科学基金资助项目(2021JJ30018,2022JJ30451);湖南省科技创新计划基金资助项目(2021RC3102,2022RC1226);湖南省教育厅基金资助项目(20B448,20B433,21A0244);湖南省中医药管理局重点基金资助项目(2021205);长沙市杰出创新青年培养计划基金资助项目(kq1802008);长沙市科技计划基金资助项目(kh2201060);中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地开放基金资助项目(2022FTKFJJ14);湖南中医药大学校级重点基金资助项目(2019XJJJ032,2019XJJJ070);湖南省研究生科研创新基金资助项目(CX20210723,2022CX64);

文章来源:王华,袁霞红,刘羽等.百事乐加味方对卒中后抑郁大鼠小胶质细胞焦亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2023,39(13):