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夏枯草提取物对环磷酰胺小鼠免疫调节作用的实验研究

2023-08-10 128 上传者：管理员

摘要：通过分析检测IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等炎症因子，探究夏枯草提取物的抗炎作用。研究证实，夏枯草提取物具有显著的免疫调节作用，为临床使用夏枯草制剂以及研究中药新药提供了有力的理论依据。

关键词：
免疫调节
夏枯草提取物
慢性疾病
炎症因子
病理现象
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炎症（Inflammation）是机体针对各种致炎因子的损伤作用所发生的以血管渗出为中心的防御性反应[1]，是人类疾病中最常见而又十分复杂的病理现象，也是很早发现并且能在临床确诊的疾病之一。在临床上，炎症与多种疾病息息相关而且有很大危害，包括常见的动脉粥样硬化、关节炎、炎症性肠综合征、身体损伤、老年痴呆症以及其他疾病的感染，炎症的发生可以驱动和调节几乎所有常见的急慢性疾病。炎症反应与大量炎症因子的合成和释放相关，是一个非常复杂的过程。炎症因子是一组涉及炎症反应或抗炎作用的多功能物质，取决于炎症反应的方式。促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β能够扩增并且启动炎症的全过程，而抗炎细胞因子如TGF-β、IRA、IL-6和IL-10却对该过程起到负调节作用[2]。目前临床上使用的抗炎药主要有非甾体类抗炎药、皮质类固醇激素、甾体类抗炎药、中药类等。非甾体类抗炎药因其临床疗效显著，成为仅次于抗感染药物的第二大类治疗药物。但如果经常使用抗炎类药物，其副作用很大，会对机体的心血管系统造成不同程度的损害，而且还会带来比较严重的胃肠反应[3]，所以从中医药宝库中发掘和寻找能够调节炎症因子的药物是缓解炎症疼痛的优势途径之一。

夏枯草（Prunella vulgaris L）为唇形科植物夏枯草的干燥果穗，是一种药食同源的药物，广泛分布于全国各地，是中医临床常用的清热泻火药物之一，具有清肝明目、泻火消肿散结的效果，临床经常治疗头痛目赤肿痛、眩晕、瘿瘤、瘰疬和乳痈肿痛等[4,5]。现代研究表明，夏枯草主要含有甾醇类、黄酮类、有机酸类、酚酸类、香豆素类、萜类、糖类以及挥发油类化学成分，能够降血压、降血糖、调节血脂，而且具有抑菌抗炎的效果，具有抑制病毒生长、清除自由基和抗肿瘤以及抗氧化的作用[6,7,8]。夏枯草的降压作用和抗肿瘤作用已被广大学者深入研究，但查阅文献发现，目前针对夏枯草抗炎作用的研究较少。因此，我们以此为切入点，通过分析检测IL-10、IL-8、IL-6、TNF-α和白细胞介素-1β(IL-1β）等炎症因子，探究夏枯草提取物抗炎的活性作用，为临床开发该类中药新药以及使用其制剂和后续相关的研究提供有力的理论依据。

1、实验材料

1.1实验动物

购买甘肃中医药大学实验动物中心的SPF级健康KM实验小鼠48只，雌雄各占一半，体重在（20±2)g之间，合格证号：SCXK（甘）2011-0001。适应性喂养1周。

1.2实验药材

夏枯草原药材购自黄河药市，并邀请甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定确定其种属基源。采取水煎煮法对夏枯草进行提取：取购买的干燥夏枯草果穗适量，除去杂质，分别用10倍量和8倍量蒸馏水煎煮提取2次，30 min/次。提取液浓缩到1 g/m L（以生药量计），冷藏备用。注射用环磷酰胺：通化茂祥制药有限公司，批号：国药准字H22022233。吲哚美辛肠溶片：广东华南药业集团有限公司，批号：国药准字H44020701。

1.3实验试剂

小鼠IL-1βELISA试剂盒、小鼠IL-6 ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒、IL-8 ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司。

1.4实验仪器

电子天平FA2104B（上海精密仪器仪表有限公司）；中科都菱超低温冰箱（上海巴玖实业有限公司）；HH-8数显恒温水浴锅（常州市凯航仪器有限公司）；奥林巴斯IX71-22FL/PH倒置荧光显微镜（上海宣浦化工有限公司）；TG-18W高速离心机（博科公司）；TC-120智能程控生物组织自动脱水机（湖北泰维医疗科技有限责任公司）；BKQ-B7511立式压力蒸汽灭菌器（山东博科消毒设备有限公司）；BBS-DDC单人洁净工作台（博科公司）；日本东芝TBA-120FR全自动生化分析仪（上海聚慕医疗器械有限公司）；艾本德移液器（上海巴玖实业有限公司）。

1.5实验方法

1.5.1动物分组

将48只小鼠随机分成6组：夏枯草提取物高、中、低剂量组，吲哚美辛组，模型组，空白组，每组8只。

1.5.2动物造模

根据齐丽娟等[9,10]的造模方式，于实验开始第3天，模型组、吲哚美辛组、夏枯草提取物高剂量组、夏枯草提取物中剂量组、夏枯草提取物低剂量组小鼠皮下注射环磷酰胺20 mg/kg，空白组小鼠每日皮下注射等体积的生理盐水，连续注射4 d，每日1次。实验第7天，取各组小鼠尾血备用。

1.5.3给药方法

自实验第8天开始，向夏枯草提取物低、中、高剂量组分别灌胃给药5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg夏枯草提取物浓缩液（以生药量计），其中夏枯草提取物中剂量组用药量由临床上正常成人用药量折合而得，夏枯草提取物低剂量组为其半量，夏枯草提取物高剂量组为其两倍量，吲哚美辛组灌胃吲哚美辛肠溶片悬混液8 mg/kg，空白组和模型组给予蒸馏水10 m L/kg灌胃，每天1次，连续21天。

1.5.4标本采集

末次给药24 h、禁食不禁水12 h后2%戊巴比妥钠ip（腹腔注射）麻醉，摘眼球取血，待血液自然凝固后离心（3 000 r/min×10 min），用移液枪取上层血清，注入1.5 m L EP管-4℃保存待测。

1.6指标检测

采取ELISA方法进行检测，严格按照说明书进行操作，检测实验小鼠的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α值，若TNF-α、IL-1β含量降低，IL-10、IL-8、IL-6含量升高说明实验结果阳性。

1.7统计分析

选用SPSS23.0统计软件进行统计分析比较，用配对t检验比较自身前后数据，若符合正态分布，采用单因素方差分析进行组间差异性比较；若不符合正态分布，采用多个独立样本非参数检验。所有数据均采用（±s）形式表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2、实验结果

2.1各组环磷酰胺模型小鼠的免疫抑制影响

与空白组比较，其他各组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β含量明显增高（P<0.05),IL-10、IL-8、IL-6的含量明显降低（P<0.05），见表1、图1。免疫反应相关指标含量明显改变说明环磷酰胺损害了小鼠免疫系统，环磷酰胺小鼠模型制备成功；同时不同剂量夏枯草提取物可以参与机体免疫反应，调节机体免疫因子含量。

表1各组环磷酰胺模型小鼠的免疫抑制影响比较（±s,pg/m L)

图1各组小鼠的免疫抑制结果分布图

2.2夏枯草提取物对各组小鼠炎症因子的影响

和空白组比较，模型组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β含量明显升高（P<0.05），而血清IL-10、IL-8、IL-6的含量明显降低（P<0.05），说明注射环磷酰胺后对小鼠免疫系统造成了损伤；与模型组对比发现，吲哚美辛组和夏枯草提取物低、中、高各剂量组大鼠血清中的TNF-α、IL-1β含量明显降低（P<0.05），而血清IL-10、IL-8、IL-6的含量明显升高（P<0.05）。具体见表2、图2。

表2夏枯草提取物对各组小鼠炎症因子影响的比较（±s,pg/m L)

3、讨论

3.1注射环磷酰胺造模后造成了小鼠免疫系统的损伤

环磷酰胺是一种临床上经常使用的免疫抑制剂，其能够抑制机体细胞增殖，从而影响机体体液免疫反应和细胞免疫反应，造成受体免疫功能低下。使用环磷酰胺制作免疫功能低下的小鼠模型，可通过检测与免疫反应相关的指标来研究对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用，因此实验室经常使用其作为常用的造模药物[11,12]。目前很多研究说明环磷酰胺能够有效地抑制动物细胞和体液的免疫应答，造成动物的免疫抑制[10,13,14]。很多学者将环磷酰胺作为建立小鼠抑制模型的常用药物，用来对比分析免疫促进药物对机体免疫系统的影响[15,16]。环磷酰胺是临床常用的细胞毒类化疗药，它能够破坏机体的DNA结构，从而达到阻断其复制的目的，最终使细胞死亡。在免疫毒理学研究中，它也是制作免疫抑制模型的常用药物之一[17]。本研究连续注射环磷酰胺后结果显示，与空白组相比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量明显增加，而IL-10、IL-8、IL-6的含量显著下降，说明注射环磷酰胺后对小鼠免疫系统造成了损伤。

图2各组小鼠的炎症因子影响结果分布图

3.2夏枯草及其提取物具有抗炎、提高免疫的作用

夏枯草味辛、苦，性属寒，归于肝、胆二经，可清肝明目、消肿散火散结[4]。相关研究显示，夏枯草的提取物，包括乙酸乙酯萃取部位、醇提取物和水提取物都有降血压、降血糖、消炎抗菌、抗肿瘤、免疫抑制、保肝、调节免疫的作用[6,7,8]。有研究表明[18]，夏枯草提取物不但能够抑制小鼠一氧化氮（NO）和前列腺素E2(PGE2）的产生，还可以减少脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中白介素-6(IL-6）以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α）的分泌。另外，通过抑制NF-κB活性的转录因子，夏枯草提取物抑制了LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症相关的诱导型人环氧化酶2(COX-2）和一氧化氮合酶（i NOS）的基因表达，从而达到抗炎的目的[19]。

Jun等[20]的研究证明，70%的夏枯草乙醇提取物对RAW264.7细胞有着明显的消炎作用，能够通过PI3K/Nrf2途径诱导血红素加氧酶-1蛋白的表达，还能降低CPL（己内酰胺）诱导的败血症小鼠血清中HMGB1和LPS激活的巨噬细胞的释放程度。除此之外，其还可以诱导PI3K/AKt介导的Nrf2活性，通过诱导内皮型一氧化氮合酶（e NOS）以及血红素加氧酶-1的表达来抑制ROS/NF-κB途径，从而对高血糖诱导的血管炎症有显著的抑制作用[21]。Rui等[22,23,24]研究表明，夏枯草提取物还能够影响小鼠的免疫功能，研究中把小鼠随机分为1个空白组、3个治疗组，每组10只小鼠，治疗组为高、中、低剂量组，分别给予浓度为0.15g/kg、0.30 g/kg和0.90 g/kg的夏枯草提取物，对照组给予纯净水，连续给药30天，通过ELISA法以及FACS确定活性淋巴细胞和T淋巴细胞亚群，测量各组小鼠血清中细胞因子的浓度，结果显示，对于非特异性免疫，在寻常性假单胞菌治疗的小鼠中，NK细胞活性以剂量依赖性方式明显增加，在高剂量和中剂量寻常性假单胞菌治疗的小鼠中，单核巨噬细胞的功能显著升高，而对于体液免疫，在溶血斑数量、溶血值（HC50）和血清Ig G水平等方面并没有显著性差异，高剂量组小鼠外周血活动性T细胞和Th淋巴细胞百分比有着明显的升高，而且这4组小鼠之间的IL-10、IL-4和IL-1β和γ-干扰素（IFN-γ）水平没有明显的差异，也就说明高剂量组的夏枯草提取物对实验小鼠的非特异性免疫功能和细胞免疫功能有影响，并且对耐多药结核分枝杆菌感染小鼠的免疫功能具有调节作用。陈勤等[25]根据药典方法改进“夏枯草膏”所得剂型———夏枯草口服液，对模型小鼠连续灌胃7天，能够明显抑制巴豆油所诱导的小鼠耳肿胀，而且还对大鼠棉球肉芽肿、大鼠蛋清性和角叉菜胶性足肿胀模型抑制作用明显。夏枯草和红糖组成的夏枯草胶囊[26]对溃疡性结肠炎也有一定的治疗作用，该机制主要是通过上调外周血T淋巴细胞的亚群值来调节免疫作用。

国外也有研究发现[27]，从夏枯草中提取的桦木酸及2α,3α-二羟基乌苏-12烯-28酸、2α-羟基熊果酸、熊果酸等一系列三萜类成分对经培养的RBL-2H3细胞中β-氨基己糖苷酶的释放呈现出量效关系和明显的抑制作用，表明其具有较强的抗炎活性。夏枯草内含有丰富的化学成分，包括黄酮类、萜类、挥发油类、香豆素类、酚酸类、糖类、甾醇类及有机酸类等，由于其药理作用显著，疗效好，越来越受到临床关注，应用广泛。但夏枯草提取物提取方法不同，其有效成分也有所不同，药理作用不同，治疗效果也有所差异。对于夏枯草的提取方法、作用机制等方面还有待进一步做更深入细致的研究。

综上所述，夏枯草提取物对实验小鼠机体的免疫调节作用明显，为临床开发中药新药提供了很好的理论依据和数据支持。

参考文献:

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基金资助:2021年甘肃省教育厅创新基金项目(2021A-314); 2022年甘肃省教育厅教育科技创新科研项目创新基金(2022A-253);