骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种关节软骨的进行性退化疾病，是常见的风湿性疾病，主要特征是关节软骨破坏、软骨下骨改变、滑膜炎等，能够导致关节疼痛、僵硬、畸形等症状[1,2]。从《黄帝内经》中可知骨关节炎在中医上属于“骨痹”范畴，即因气血亏虚，风、寒、湿、热等外邪侵袭人体，闭阻经络，导致气血运行不畅、筋骨失养，可通过补益肝肾、调和气血，祛湿散寒，利湿清热，活血化瘀，化痰通络来治疗。正骨紫金丸源自《医宗金鉴·正骨心法要旨》,书载：治跌打扑坠闪挫损伤，并一切疼痛，瘀血凝聚。正骨紫金丸是书中使用最广泛的内服药物，研究显示正骨紫金丸可以促进创伤性骨折患者的软骨组织修复[3]。已知正骨紫金丸由丁香、莲子、熟大黄、儿茶、白芍、血竭、牡丹皮、当归、木香、茯苓、红花、甘草组成，方中血竭、牡丹皮与熟大黄、儿茶联合具有活血化瘀、疗伤止痛之功，丁香、木香能够行气散寒止痛，当归、白芍有补血活血、养血柔肝之效，莲子、茯苓两者能够健脾益肾、宁心安神。因此，本研究猜测正骨紫金丸对骨关节炎有一定的治疗作用。磷脂酰肌醇3激酶(The Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，可促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)的生成，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(The Serine/threonine Protein Kinase, AKT)是PI3K信号传导中的重要信使，mTORC1是AKT的一个关键下游分支，磷酸化AKT可以在Ser2448处磷酸化mTORC1[4,5]。有研究已经证明淫羊藿苷可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，对骨关节炎软骨组织进行保护[6]。因此，基于上述报道，本研究旨在探讨正骨紫金丸是否能够通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对关节炎大鼠的软骨组织发挥保护作用，现报告如下。

1、材料和方法

1.1实验动物

SPF级Wistar大鼠，8周龄，体重为180～220 g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号为SCXK(辽)2020-0002。

1.2实验药品和试剂

正骨紫金丸(沈阳东新药业有限公司，国药准字Z20093095);硫酸氨基葡萄糖片(新兴同仁药业有限公司，国药准字H20041317);3-甲基腺嘌呤(3-MA,货号为HY-19312,美国MedChemExpress公司);HE染色试剂盒(货号为E-IR-R117,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号为40306ES20,翌圣生物科技股份有限公司);白细胞介素(IL)-6,肿瘤坏死因子(TNF)-α,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)ELISA试剂盒(货号为YK-07378、YK-07342、YK-10010,北京伊塔生物科技有限公司);丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(货号为ml3020、mlE2337,上海酶联生物科技有限公司);ULK1、Beclin1、LC3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR一抗(货号为ab167139、ab207612、ab128025、ab302959、ab278545、ab8805、ab38449、ab32028、ab109268,英国Abcam生物公司);山羊抗兔IgG(货号为WLA023,沈阳万类生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1大鼠模型制备及分组

将所有大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组、正骨紫金丸组、正骨紫金丸+3-甲基腺嘌呤组(正骨紫金丸+3-MA),每组10只。除对照组外，其余组均参照文献[7]方法诱导骨关节炎大鼠模型，在右膝关节内注射2 mg碘乙酸钠(MIA)以诱导膝关节骨关节炎，对照组注射等量生理盐水。在诱导第7天，阳性组以0.17 g/kg剂量灌胃硫酸氨基葡萄糖[8];正骨紫金丸组根据大鼠与人的用药剂量换算后以0.36 g/kg的剂量进行灌胃[3];正骨紫金丸+3-MA组灌胃0.36 g的正骨紫金丸，同时腹腔注射1.5 mg/kg的自噬抑制剂3-MA[9];对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水。2次/d,持续28 d。

1.3.2苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠关节软骨组织情况

所有大鼠麻醉后处死，取右后肢膝关节并分离其关节软骨组织冻存于-80℃。然后每组随机取5个组织在4%多聚甲醛中固定过夜，然后石蜡包埋切片，经过二甲苯和乙醇脱蜡后进行HE染色，再次用乙醇脱水和二甲苯透明，最后树脂封片，并在光学显微镜下观察软骨组织形态。

1.3.3 TUNEL染色检测关节软骨组织的细胞凋亡率

取1.3.2节中的石蜡切片，先进行脱蜡和水化，然后将切片放入含有蛋白酶K的溶液中孵育30 min。PBS清洗后将切片用提前配好的TUNEL工作液染色，37℃避光1 h,再用DAPI溶液复染15 min, PBS清洗后封片。用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。

1.3.4 ELISA检测血清中白细胞介素(IL)-6,肿瘤坏死因子(TNF)-α,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量

在大鼠被处死之前，对所有大鼠进行腹腔采血2 mL,4℃,1 000g离心10 min,收集上清液。根据ELISA检测试剂盒操作步骤检测血清中IL-6、TNF-α、iNOS含量。

1.3.5检测关节软骨组织中MDA含量和SOD活性

在冻存的软骨组织中每组随机选取5个样本并研磨，然后在4℃下3 000g离心10 min,取上清液并利用试剂盒检测MDA的含量以及SOD的活性。

1.3.6 Western Blot检测关节软骨组织中自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白

取1.3.2节中冻存的关节软骨组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，BCA测定蛋白质浓度。然后用SDS-PAGE分离蛋白并转至PVDF膜。接着将PVDF膜用5%的脱脂牛奶封闭过夜，第2天用一抗稀释液(ULK1、Beclin1、LC3、PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR比例1∶1 000,AKT、p-AKT比例为1∶500)在室温下孵育1 h,再用羊抗兔二抗稀释液(稀释比例为1∶2 000)在室温下孵育1 h,然后ECL显色，用膜扫描仪成像并拍照，以GAPDH为内参蛋白，用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值。

1.4统计学方法

利用GraphPad Prism 8.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料用x¯±s形式表示，多组比较用one-way ANOVA,两两多重比较用q检验，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1正骨紫金丸对骨关节炎大鼠关节软骨组织病理形态的影响

苏木精-伊红染色结果显示，与对照组相比，模型组大鼠关节软骨损伤明显，软骨软化，表面粗糙，染色强度不均匀，软骨细胞排列不规则，细胞聚集明显；与模型组相比，阳性组和正骨紫金丸组大鼠软骨损伤减轻，软骨细胞排列整齐，细胞聚集明显减少；与正骨紫金丸组相比，正骨紫金丸+3-MA组大鼠软骨损伤加重，见图1。

图1各组大鼠关节软骨组织的病理损伤(HE染色,×100)  

2.2正骨紫金丸对骨关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡的影响

与对照组相比，模型组大鼠关节软骨中细胞凋亡升高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比，阳性组和正骨紫金丸组关节软骨中细胞凋亡降低，差异有统计学意义(P<0.05),且两组间差异无统计学意义(P>0.05);与正骨紫金丸组相比，正骨紫金丸+3-MA组关节软骨中细胞凋亡升高，差异有统计学意义(P<0.05),见图2和表1。

2.3正骨紫金丸对骨关节炎大鼠血清中IL-6、TNF-α、iNOS含量的影响

与对照组相比，模型组血清中IL-6、TNF-α、iNOS的含量升高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比，阳性组和正骨紫金丸组血清中IL-6、TNF-α、iNOS的含量降低，差异有统计学意义(P<0.05),且两组间差异无统计学意义(P>0.05);与正骨紫金丸组相比，正骨紫金丸+3-MA组血清中IL-6、TNF-α、iNOS的含量升高，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

图2各组大鼠关节软骨细胞凋亡情况(TUNEL染色,×200)  

表1各组大鼠关节软骨组织的细胞凋亡率(x¯±s,n=5)

注：1)与对照组相比，P<0.05;2)与模型组相比，P<0.05 ;3)与正骨紫金丸组相比，P<0.05。

2.4正骨紫金丸对骨关节炎大鼠关节软骨组织中MDA、SOD水平的影响

与对照组相比，模型组软骨组织中MDA的含量升高，SOD活性降低，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比，阳性组和正骨紫金丸组软骨组织中MDA的含量降低，SOD活性升高，差异有统计学意义(P<0.05),且两组间差异无统计学意义(P>0.05);与正骨紫金丸组相比，正骨紫金丸+3-MA组软骨组织中MDA的含量升高，SOD活性降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表2各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、iNOS的含量(pg/mL,x¯±s,n=5)

表3各组关节软骨组织中MDA含量和SOD活性(x¯±s,n=5)

2.5正骨紫金丸对骨关节炎大鼠软骨组织中自噬相关蛋白以及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组中软骨组织中ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达升高(P<0.05);与模型组相比，阳性组和正骨紫金丸组软骨组织中ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达降低(P<0.05),且两组间差异无统计学意义(P>0.05);与正骨紫金丸组相比，正骨紫金丸+3-MA组软骨组织中ULK1、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达升高(P<0.05),见图3及表4。

图3各组大鼠关节软骨组织中自噬及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的条带  

表4各组大鼠关节软骨组织中自噬及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的相对表达量(x¯±s,n=5)

3、讨论

骨关节炎是老年人中最常见的退行性关节疾病，最常发生在膝关节，会导致严重的关节疼痛和残疾。

在病理学上，骨关节炎的特征主要包括关节软骨退化、软骨下骨硬化、边缘骨赘形成和滑膜炎症[10]。已知骨关节炎属中医“骨痹”范畴，年老体弱，气血失和，肝血肾精渐亏，筋骨失养是骨关节炎发生的内在基础。正骨紫金丸是治疗跌打损伤、瘀血肿痛等多种炎症反应性疾病的中药小水丸剂，该药方的成分具有活血化瘀、行气散寒、补血活血、健脾益肾、强筋健骨等功效[11]。因此，本研究探讨了正骨紫金丸是否对骨关节炎产生治疗作用。本研究通过建立骨关节炎大鼠模型进行体内实验，苏木精-伊红染色结果发现模型组大鼠关节软骨损伤明显，软骨细胞凋亡率升高，表明骨关节炎大鼠模型建立成功。而阳性组和正骨紫金丸组中大鼠软骨组织损伤较模型组有所减轻，软骨细胞排列整齐，细胞聚集明显减少，揭示正骨紫金丸可以减轻骨关节炎大鼠关节软骨的病理性损伤。

炎症和氧化应激是促进骨关节炎发展的主要发病机制，两者相互依存。炎症介质如IL-6、TNF-α和iNOS在骨关节炎关节中高表达并诱导活性氧(ROS)的产生，而过度的炎症反应诱导的软骨细胞凋亡也是关节炎中软骨损伤的主要机制[12,13]。氧化应激是活性氧的产生和抗氧化防御系统对其清除之间不平衡的结果，活性氧在骨关节炎软骨中过度积累，也是慢性炎症的主要原因。SOD是细胞抗氧化应激的防御酶之一，可以清除体内氧自由基，维持代谢平衡。MDA是脂质过氧化的产物，被认为是氧化应激强度的标志[14,15]。本研究通过对炎症和氧化应激因子的分析发现，与模型组相比，阳性药物和正骨紫金丸处理后大鼠血清中的炎症介质IL-6、TNF-α、iNOS以及MDA含量降低，SOD活性升高，揭示正骨紫金丸可以减轻骨关节炎大鼠关节软骨的炎症和氧化应激损伤，其作用与阳性药物无显著差异。

大量研究已经证明PI3K/AKT/mTOR通路是细胞内必不可少的信号通路，其对自噬活性是负向调控的作用，并且该通路在炎症反应、软骨细胞凋亡、代谢等过程中起着关键作用[16,17]。自噬是一种应激防御机制，通过形成自噬体降解受损细胞和细胞器，维持细胞的稳定状态[18]。ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是人体细胞中必不可少的自噬相关基因。此外，Beclin1和LC3也是参与自噬过程的生物标志物，由于可溶性LC3(LC3Ⅰ)向自噬囊泡相关形式(LC3Ⅱ)的转化参与自噬体形成，因此LC3Ⅱ/Ⅰ的比率是自噬的重要标志[19,20]。本研究结果显示，阳性药物和正骨紫金丸处理组大鼠软骨组织中ULK1、Beclin1蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著高于模型组，PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化表达显著低于模型组，且阳性组和正骨紫金丸组无显著差异；而进一步加入自噬抑制剂3-MA后，提高了PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化表达，且逆转了正骨紫金丸对关节软骨的保护作用，揭示正骨紫金丸能够促进软骨细胞的自噬，减轻软骨组织损伤，其可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的。

综上所述，正骨紫金丸能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，对关节炎大鼠的软骨组织发挥保护作用，本研究为骨关节炎的治疗提供了新的药物和研究方向。正骨紫金丸是中药小水丸剂，具有成分多、治疗靶点多等优点，因此，其保护关节炎软骨组织的更多其他机制还需要进一步深入研究。

参考文献:

[3]景希强,徐杰正骨紫金丸对创伤性骨折患者软组织修复及骨折愈合的影响[J]中国社区医师,2021,37(10):57-59

[8]莆智,李浩,王晓旭,等罗汉果皂苷VI对膝骨关节炎大鼠模型的治疗作用及其机制探讨[J].免疫学杂志,2022,38(9):804-809.

[9]秦娜,魏立伟,张虹.桃仁膝康丸通过PI3KIAKT/mTOR信号通路激活软骨细胞自噬抗膝骨性关节炎的机制研究[J].中药药理与临床,2021,37(4):165-169.

[11]杜洋,李石头正骨紫金丸联合手术治疗桡骨远端骨折的临床效果[J]河南医学研究, 2022,31(6):1107-1110.

文章来源:刘吉斌,周宇,于庆瑞.正骨紫金丸对骨关节炎大鼠软骨组织的保护作用及其机制[J].中国中医骨伤科杂志,2023,31(08):7-12.DOI:10.