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番石榴叶提取物对大鼠糖脂代谢和关节软骨的影响

2023-08-10 91 上传者：管理员

摘要：本研究旨在探讨番石榴叶提取物对2型糖尿病(T2DM)大鼠的影响及其在膝关节液中MMP-3水平的调节作用。实验采用高强度跳跃运动作为干预措施，观察大鼠在番石榴叶提取物干预下的糖脂代谢、关节软骨损伤和炎症反应指标的变化。结果显示，番石榴叶提取物可显著改善T2DM大鼠的糖脂代谢和胰岛素敏感性，降低血清中氧化促炎因子的水平，并减轻膝关节软骨损伤程度。研究表明，番石榴叶提取物可能通过调节胰岛素抵抗、抗氧化和抑制炎症反应的机制发挥其保护作用。这些发现为番石榴叶提取物在T2DM相关关节损伤的预防和治疗中提供了科学依据。

关键词：
2型糖尿病
关节软骨损伤
炎症反应
番石榴叶提取物
糖脂代谢
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番石榴叶是番石榴属植物的干燥叶片和带叶嫩茎，被广泛用于中医传统中，具有燥湿健脾、清热解毒的功效。番石榴叶中含有丰富的黄酮、酚类、多糖、皂苷和挥发油等功能性成分，尤其是总黄酮和总三萜(来自番石榴叶的总三萜类化合物,TTPGL)具有消炎、抗氧化、降血糖和血脂、抗病毒等作用(Alnaqeeb et al.,2019;Luo et al.,2019;Shabbir et al.,2020;Kumar et al.,2021;Nasir et al.,2021;Lok et al.,2023)。在中国，番石榴叶作为民间常用的糖尿病(diabetes mellitus,DM)防治食品近年来受到广泛关注。

番石榴叶提取物可通过上调骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信号通路和IRS-PI3K-AKTGLUT4信号通路来降低血糖，通过上调PI3K/Akt信号通路来调节凋亡相关基因的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡和缓解胰岛素抵抗(Guo et al.,2013)。此外，还有研究发现番石榴叶提取物通过调节Wnt/β-catenin信号通路和抑制软骨细胞内活性氧(反应性氧化物,ROS)水平，减少MMP-3的释放和软骨细胞凋亡。

最近研究表明，番石榴叶提取物通过促进棕色脂肪细胞分化来调节脂质代谢。由于其改善糖脂代谢和保护关节软骨的功效，番石榴叶提取物可能适用于有运动习惯的2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者，作为日常保健和预防关节损伤的食品。然而，目前尚缺乏相关研究支持此观点。因此，本研究旨在探究连续摄入番石榴叶提取物对2型糖尿病合并软骨损伤模型大鼠的糖脂代谢调节和关节软骨保护效果。

1、结果与分析

1.1番石榴叶提取物对T2DM大鼠体重的影响

研究结果表明(表1)：在建模后，MC组、E组和I组的大鼠体重显著低于NC组(P<0.05)，表明建模后的大鼠体重超过正常大鼠。在干预后，E组和I组的大鼠体重显著低于MC组(P<0.05)，表明干预对模型大鼠的体重产生了影响。

1.2番石榴叶提取物对T2DM大鼠糖代谢的影响

研究结果表明(表2):MC组、E组和I组大鼠的FBG、FSI和HOME-IR 3项前测指标均显著高于NC组，表明T2DM造模成功，大鼠出现糖代谢异常和胰岛素抵抗。E组和I组大鼠FBG、FSI和HOME-IR后测结果与前测比较出现明显下降(P<0.05)。I组大鼠FBG、FSI和HOME-IR后测结果显著低于E组和MC组(P<0.05)。

1.3番石榴叶提取物对T2DM大鼠脂代谢的影响

研究结果表明(表3):MC组、E组和I组大鼠的TG、TC、LDL-C前测指标均显著高于NC组，HDL-C指标显著低于NC组，表明T2DM造模中的高脂高糖喂食引发了大鼠脂代谢异常。E组和I组大鼠的TG、TC、LDL-C后测结果与前测相比显著下降(P<0.05)，而HDL-C则显著上升。I组大鼠的TG、TC、LDL-C后测结果低于E组，但差异不具有显著性(P>0.05)。

1.4番石榴叶提取物对膝关节软骨表面形态的影响

研究观察表明(图1)：经过8周的跳跃训练后，E组大鼠的膝关节软骨表面可见微小裂痕、光滑度不足，滑膜明显肿胀，细胞排列紊乱且数量明显增加，形成细胞集落。相比之下，I组大鼠的膝关节软骨表面光滑度更高，裂痕较浅且数量更少，细胞数量增加不明显且排布较为整齐(P<0.05)。与未进行运动的NC组和MC组大鼠相比，I组大鼠的膝关节软骨表面形态更接近正常状态。

1.5番石榴叶提取物对细胞因子水平的影响

研究结果表明(表4):MC组、E组、I组大鼠的MDA、IL-1β和TNF-α前测指标均显著高于NC组，而SOD指标显著低于NC组，表明T2DM造模后大鼠出现了氧化应激和系统性炎症反应。E组大鼠的MDA、IL-1β和TNF-α后测结果与前测相比明显升高(P<0.05)，而I组大鼠的MDA、IL-1β和TNF-α后测结果则明显降低(P<0.05)。此外，I组大鼠的SOD后测结果显著增加(P<0.05)。与E组相比，I组大鼠的MDA、IL-1β、TNF-α和SOD后测结果存在显著差异(P<0.05)。

图1各组大鼠膝关节软骨细胞HE染色切片(×50)

表1大鼠体重变化趋势

表2 FBG,FSI,HOME-IR变化

表3大鼠脂代谢指标

表4大鼠细胞因子水平

1.6番石榴叶提取物对膝关节液中MMP-3水平的影响

研究结果表明(图2):MC组、E组和I组接受T2-DM造模的大鼠在前测时的MMP-3蛋白水平和酶活性均显著高于NC组大鼠(P<0.05)。经过8周的高强度跳跃训练后，E组大鼠的MMP-3蛋白水平和酶活性显著高于NC组和MC组大鼠(P<0.05)，而经过同样的高强度跳跃干预后，I组大鼠的MMP-3蛋白水平和酶活性与前测相比并未显著升高。

2、讨论

2.1糖脂代谢和胰岛素敏感性

糖尿病是一种代谢性疾病，具有高血糖和胰岛素抵抗的特征。本研究观察到接受番石榴叶提取物和高强度跳跃运动干预的大鼠，其空腹血糖水平(fasting blood glucose,FBG)、空腹胰岛素水平(fasting insulin,FSI)和胰岛素抵抗指数(the homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)均得到明显改善。这表明番石榴叶提取物具有调节糖脂代谢和胰岛素敏感性的潜力。先前的研究也证实了番石榴叶提取物对血糖和胰岛素水平的调节作用，包括降低糖化血红蛋白和血浆胰岛素水平，并增加某些葡萄糖代谢酶的活性。此外，番石榴叶提取物中的有效物质TTPGL被认为可以通过调节胰岛细胞的凋亡和增加胰岛细胞数量来保护胰岛功能，从而改善血糖控制。

2.2脂代谢异常和胆固醇水平

脂代谢异常是T2DM患者常见的代谢紊乱之一，本研究观察到接受番石榴叶提取物和高强度跳跃运动干预的大鼠，其甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显下降，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显上升。这表明番石榴叶提取物具有改善脂代谢异常的作用。先前的临床试验也支持了番石榴叶提取物对降低血清胆固醇水平的效果。番石榴叶提取物可能通过抑制葡萄糖进入血液的速度，减少游离脂肪的产生，以及增加能量物质供能的顺序来改善脂代谢异常。

2.3氧化应激和炎症反应

T2DM常伴随氧化应激和全身性炎症反应的增加。本研究观察到接受高强度跳跃运动的大鼠，其血清和关节液中氧化促炎因子的水平(如MDA,IL-1β,TNF-α)明显升高。然而，接受番石榴叶提取物的大鼠在高强度跳跃后，其氧化促炎因子的水平显著下降，并且膝关节软骨损伤程度较轻。这说明番石榴叶提取物可能通过清除炎症因子和保护关节软骨来减轻氧化应激和炎症反应的程度。此外，番石榴叶提取物能够提高抗氧化酶活性，清除脂质过氧化物和晚期糖基化终末产物，从而减少炎性物质的生成和软骨基质降解。

综上所述，长期摄入番石榴叶提取物能够有效改善T2DM大鼠的糖脂代谢和胰岛素敏感性，降低跳跃引发的膝关节软骨炎症因子表达，减少MMP-3活性，缓解软骨表面和滑膜损伤，并抑制软骨基质降解。这些研究结果为番石榴叶提取物在T2DM相关关节损伤的预防和治疗中的潜在应用提供了科学依据。然而，仍需要进一步研究来探索其具体的作用机制，并进行临床试验以验证其在人体中的应用价值。

图2 MMP-3蛋白水平和酶活性

3、材料与方法

3.1实验动物

本研究使用40只SPF级雌性SD大鼠，从重庆医科大学动物中心[SCXK(渝) 2017-0023]购得，年龄为8周，体重在190～220 g。大鼠在实验室动物房内进行适应性饲养，环境温度维持在25℃，相对湿度为55%，采用12 h明暗循环。大鼠分别单独放置在笼子中，供给充足的饮水和食物。在实验过程中，我们遵循科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》来进行动物处置。

3.2番石榴叶提取物的制备

番石榴叶药材原料购自四川医药集团(产地桂林)，按照苏通等提取工艺进行制备，具体步骤如下：

(1)将番石榴叶片粉碎，取粗粉1.1 kg，用3倍量的醋酸乙酯在恒温(26℃)下进行60 MHz超声波提取，每次提取11 min，共进行7次提取。过滤并保留提取渣，然后使用5倍量的乙醇进行超声提取，每次提取15 min，共进行4次提取。收集过滤液并浓缩，得到浸膏。

(2)将浸膏与3倍量的水混合制成混悬液，使用离心机以6 000 r/min的速度离心15 min，收集上清液Ⅰ。

(3)将剩余的药渣使用5倍量的水进行超声提取，每次提取40 min，共进行2次提取。将2次过滤得到的滤液合并，再次以6 000 r/min的速度离心15 min，得到上清液Ⅱ。将上清液Ⅰ和Ⅱ合并。

(4)采用改良的明胶法去除鞣质，并再次过滤得到滤液。滤液进行聚酰胺处理，然后进行水洗脱，洗脱液进行减压浓缩，最终得到水浸膏68.10 g。以芦丁作为对照品，制作标准曲线，使用紫外分光光度法在500 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算供试品溶液中总黄酮含量为23.6%。

3.3实验分组及T2DM建模

对全部大鼠进行标号，通过分组软件，将大鼠随机分为正常对照组(normal control,NC组,n=10)、模型对照组(modle control,MC组,n=10)、运动组(Exercise,E组,n=10)、干预组(Intervention,I组,n=10)(表5)。

从40只SD大鼠中随机选择30只进行T2DM(2型糖尿病)建模。这30只大鼠接受高脂饲料喂养12周，然后在12周后进行1次腹腔注射STZ。与此同时，另外10只大鼠未接受高脂饲料喂养，在同一时间接受1次腹腔注射生理盐水。注射后的4周，禁食禁水12 h，使用血糖测试仪检测大鼠尾静脉血糖，血糖值≥16.7 mmol/L判定为成功建模。

3.4实验流程

本研究采用随机对照的动物实验设计。在大鼠适应环境后，随机选择30只大鼠进行T2DM建模。成功建模的大鼠被随机分配到MC组、E组、I组，未进行建模的大鼠分配到NC组。在进行运动干预前的24 h，收集大鼠的血样。随后，各组根据运动方案进行为期8周的干预。干预结束后，采集大鼠腹腔血和关节腔液样本，并处死大鼠并取下双侧膝关节进行贮存。

表5实验分组方案

3.5取材与样本处理

(1)血液样本采集：在注射STZ后4周(完成建模)后的48 h内，以及干预结束后的48 h内，对禁食和禁水8 h的大鼠进行采血处理(腹腔采集血样3.5 mL)，并用EDTA抗凝采样管来收集血样。设置高速低温离心机4℃恒温、8 000 r/min离心5 min，离心完成后进行血清提取，-40℃存储。

(2)次日，在采集血样后麻醉大鼠(戊巴比妥腹腔注射)，使用注射器在大鼠右后肢膝关节腔内注射0.5 mL生理盐水，重复抽吸3次，抽吸得到的生理盐水(含有关节腔液)放入EP管中。随后，处死大鼠，并将双侧膝关节置于多聚甲醛中固定48 h。使用乙二胺四乙酸溶液进行脱钙处理40 d，以制备石蜡切片。

3.6观测指标

(1)糖代谢指标：空腹血糖(FBG)的测量使用血糖仪和试纸套件，空腹胰岛素水平(FSI)使用ELISA法检测。根据稳态模型计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-IR,HOMA-IR)。

(2)脂代谢指标：使用全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度。

(3)氧化应激和炎症：使用ELISA检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和基质金属蛋白酶-3 (MMP-3)水平。

(4)关节软骨损伤：将膝关节软骨制作石蜡切片，经过逐步脱蜡至水的二甲苯和乙醇处理，然后在苏木素中染色5 min，用蒸馏水冲洗，浸泡于伊红染液中2 min，漂洗后进行脱水和封片，在显微镜下观察。

3.7数据处理

本研究使用Statistics Analysis System 9.4M6版本进行数据分析。各组大鼠在组内和组间的差异水平使用独立样本t检验和单因素方差分析(显著水平设定为α=0.05)。

基金资助:开封市哲学社会科学调研课题(ZXSKGH-2022-0702);河南省教师教育课程改革研究项目(2022-JSJYZD-060)共同资助;