脊髓损伤是一种由事故、创伤、运动损伤、结核、肿瘤等直接或间接因素引起的重大神经性疾病，通常表现为肢体的感觉与运动出现障碍、反射消失、二便失常等，全球每年有25万至50万人受其影响，具有高致残率、高死亡率等特点[1,2]。

研究发现脊髓损伤的致残更多来源于脊髓原发性损伤后的继发性损伤，因此脊髓损伤早期处理的关键在于尽量减轻继发性损伤，包括手术减压改善脊髓血液灌注、药物保护神经等[3]。过去认为使用大量糖皮质激素的冲击疗法能促进脊髓的恢复，然而近年来研究发现该疗法的副作用较大，因此建议谨慎使用[4]。中医药在脊髓损伤早期的治疗中拥有巨大潜力，前期研究发现补肾活血方对改善脊髓压迫引起的损伤有较明显的治疗效果，且副作用极小，然而机制未明[5]。因此本研究将进一步探讨补肾活血方对脊髓损伤早期大鼠模型的干预作用与机制。

1、材料

1.1动物

32只SPF级SD雄性大鼠，体质量200～250 g,购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2018-0034,饲养于广州中医药大学SPF动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK(粤)2018-0001,自由摄水饮食，昼夜节律为12 h/12 h,环境温度(24±2)℃,相对湿度55%～68%,适应性喂养1周后开始实验，实验动物伦理审查号20220803007。

1.2药物

补肾活血方每剂含巴戟天15 g、丹参15 g、仙茅15 g、熟附子15 g、虎杖15 g、牛黄0.15 g、熊胆0.5 g,由广州中医药大学第二附属医院提供。

1.3试剂与仪器

超氧化物歧化酶(superoxi dedismutase, SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司， 货号BC1170、BC0020);Bax、HO-1抗体(美国Cell Signaling Technology公司，货号14796、82206);Bcl-2、NQO-1抗体(英国Abcam公司， 货号ab28947、ab59348);GFAP抗体(武汉博士德生物工程有限公司， 货号PB9082);NeuN抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号A19086);Nrf-2抗体(美国Affinity Biosciences公司， 货号AF0639)。倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司);高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

2、方法

2.1造模

Allen’s法制备脊髓损伤大鼠。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g)致其全身麻醉后固定，剃除背部皮毛，以T10节段脊髓为中心做约3 cm切口，显露T9～T11节棘突，截去棘突和椎板，使脊髓组织完全显露。使用PinPointTM精密脊髓损伤撞击器(型号PCI3000-2)设置具体参数(打击速度1.2 m/s;打击深度1.0 mm;停置时间85 ms),击打T10脊髓，观察到被击打部分迅速充血，颜色变深红或红紫色，同时大鼠尾部、后肢出现一过性的痉挛抽搐，脊髓表面覆盖一层自体脂肪以减少粘连。随后止血并且缝合伤口，碘伏擦拭缝合处皮肤。假手术组按照以上方式只暴露脊髓组织不进行打击。

2.2分组与给药

大鼠随机分成假手术组、模型组和补肾活血方低、高剂量组，每组8只。按照人与大鼠给药剂量换算，低、高剂量为6、18 g/kg(相当于人临床剂量的1、3倍)。造模成功的次日开始给药，给药组大鼠灌胃给予相应剂量药物，每天1次，每6 d间歇1 d,每只大鼠每次灌胃2 mL,假手术组和模型组灌胃给予等体积纯水，连续干预28 d。

2.3运动功能评分

采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表[6]和足印实验评价各组大鼠后肢运动功能恢复情况。术后第1、3、7、14、21、28天时将大鼠置于旷场中自由活动，观察时间5 min,根据BBB量表评估大鼠后肢运动能力，总分0～21分(0分代表后肢完全瘫痪；21分代表后肢正常运动),分数越高，代表运动功能越好。术后第14、28天进行大鼠足印实验，记录大鼠后肢运动轨迹。

2.4取材

术后第14天取损伤脊髓组织于液氮中保存，用以Western blot实验和SOD活性、MDA水平检测；术后第28天取损伤脊髓组织经10%EDTA溶液脱钙、脱水处理后石蜡包埋切片，厚度为5μm,用于HE、Nissl染色和免疫荧光染色。

2.5 HE染色观察脊髓组织形态

取预制好的切片，脱蜡后使用苏木精-伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜下随机选取损伤区域的5个视野，观察组织病理学变化，并采用6分制进行评分，即0分，无损伤；1分，灰质可见1～5个嗜酸性神经元；2分，灰质可见6～10个嗜酸性神经元；3分，灰质可见超过10个嗜酸性神经元；4分，灰质的梗死面积小于1/3;5分，灰质梗死的面积在1/3和1/2之间；6分，灰质梗死的面积大于1/2[7]。

2.6 Nissl染色观察脊髓组织神经细胞情况

预制好的切片置于焦油紫染液中浸染、冲洗后分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜下随机选取损伤区域的5个视野，观察尼氏小体染色情况，并对包含尼氏小体的神经元计数。两名研究人员使用Image J软件分别进行独立计数，最终结果取平均值。

2.7试剂盒检测各组大鼠脊髓组织SOD活性和MDA水平

取适量脊髓组织加双蒸水匀浆，4℃、3 500 r/min离心20 min,取上清，按试剂盒说明书操作检测SOD活性和MDA水平。

2.8免疫荧光法检测脊髓组织损伤局部神经细胞及星形胶质细胞标志物水平

切片修复后，用10%山羊血清孵育，分别加入NeuN(1∶200)、GFAP(1∶200)一抗，4℃孵育过夜，再分别加入荧光二抗，常温孵育，PBS充分漂洗后用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片；以1%山羊血清代替一抗作为阴性对照，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.9 Western blot法检测脊髓组织氧化应激通路和细胞凋亡相关蛋白表达

取适量脊髓组织，匀浆后提取脊髓组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，依次进行电泳、转膜、封闭后分别加入一抗Bcl-2、Bax、NQO-1、HO-1、Nrf2,内参为GAPDH(1∶1 000),4℃孵育过夜，加入相应二抗(1∶1 000)孵育，显色、成像后计算蛋白相对表达量。

2.10统计学分析

通过SPSS 20.0软件进行处理，数据以(x¯±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1补肾活血方对脊髓损伤大鼠后肢运动功能及脊髓组织形态学的影响

足印图(图1A)显示，假手术组大鼠后肢功能正常；模型组大鼠后肢功能丧失，且术后28 d仍未能恢复；与模型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠后肢功在术后28 d均有不同程度的恢复，且高剂量组恢复更佳。BBB评分(图1B)显示，补肾活血方药物干预后，低、高剂量组在术后3 d评分与模型组几乎一致，而第7、14、21、28天时评分均高于模型组，且高剂量组评分更高，结果表明补肾活血方能恢复脊髓损伤大鼠后肢运动功能。

HE染色(图1C～1D)结果显示，术后第28天时，假手术组大鼠脊髓组织整体构造完好，无明显破坏痕迹，组织间隙与神经细胞的形态、分布均无明显异常；模型组大鼠脊髓组织可见大空洞，并伴随神经细胞形态与分布异常，组织学评分较假手术组升高(P<0.05);补肾活血方低剂量组大鼠脊髓组织仍有空洞，但缺损减轻，而补肾活血方高剂量组则仅在部分区域出现小范围空腔，部分区域恢复正常，各剂量组脊髓组织学评分较模型组降低(P<0.05)。

Nissl染色(图1E～1F)结果显示，术后第28天时，假手术组大鼠脊髓组织中可见大量尼氏小体；模型组可见脊髓组织广泛损伤，与假手术组比较尼氏体小体数量减少(P<0.05);补肾活血方各剂量组大鼠脊髓组织破坏程度减轻，尼氏体小体数量增加(P<0.05)。

图1补肾活血方对脊髓损伤大鼠后肢运动功能及脊髓组织形态学的影响(x¯¯±s,n=8)  

3.2补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织SOD活性及MDA水平的影响

术后第14天，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织SOD活性降低(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05);与模型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠脊髓组织SOD活性升高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05),见图2。

图2补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织SOD活性及MDA水平的影响(x¯¯±s,n=8)   

3.3补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织Bax、Bcl-2、NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表达的影响

术后第14天，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织Bcl-2、NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表达降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠脊髓组织Bcl-2、NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表达升高(P<0.05),高剂量组Bax蛋白表达降低(P<0.05),见图3。

图3补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织Bax、Bcl-2、NQO1、HO-1、Nrf2蛋白表达的影响(x¯¯±s,n=8)   

3.4补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织NeuN、GFAP荧光表达的影响

术后第28天，与假手术组比较，模型组NeuN几乎不表达，荧光强度减弱(P<0.05),而GFAP大量表达，荧光强度增强(P<0.05);与模型组比较，补肾活血方各剂量组NeuN荧光强度增强(P<0.05),GFAP荧光强度减弱(P<0.05),见图4。

图4补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织NeuN、GFAP荧光表达的影响(x¯¯±s,n=8)   

4、讨论

脊髓损伤早期的损害是一个渐进的过程，脊髓受损后，继发性损伤将持续进行数周到数月，因此，干预继发性损伤将直接影响疾病的预后[8]。中医将脊髓损伤早期称为“体堕”[9],并认为瘀血是其引发功能障碍的原因之一，“督络说”认为脊髓属“髓”,与督脉、肾相关，脊髓疾病可从肾论治[10]。此时督脉受损，髓海不足，加之瘀血阻滞气机，日久则肾虚。因此，治疗脊髓损伤早期当补肾活血。补肾活血方以广东省名老中医邓晋丰教授经验方“肾骨安”的巴戟天、熟附子、仙茅、丹参为基础，再加入虎杖、牛黄与熊胆以增强补肾之力。动物研究表明补肾活血方能有效改善脊髓组织的血供[5]。药理学研究表明，补肾活血方中多味中药具有抗氧化及抗细胞凋亡的作用[11,12,13,14,15,16],推测补肾活血方治疗脊髓损伤的机制可能与其抗氧化、抗细胞凋亡有关。

氧化应激是一种氧化与抗氧化失衡引起的病理反应。由于脊髓伤区的抗氧化能力较弱，其中的神经细胞易受到氧化而发生凋亡、退变等[17,18]。SOD和MDA是评估氧化应激的重要指标[19]。本研究显示，脊髓损伤发生后SOD活性降低，MDA水平升高，表明脊髓组织在损伤时出现了氧化应激反应[20]。补肾活血方干预后，脊髓组织SOD活性升高，MDA水平降低，说明补肾活血方治疗脊髓损伤的作用可能是通过抑制氧化应激反应实现。

Nrf2是一种氧化还原调节因子，在氧化应激条件下能激活HO-1、NQO1等抗氧化酶基因[21]。补肾活血方中虎杖苷、丹参酮都能激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路[22,23]。此外，研究表明补肾活血法可能跟该通路有直接联系[24]。本研究发现，与模型组比较，补肾活血方干预后，大鼠脊髓组织HO-1、NQO1、Nrf2蛋白表达均升高。因此，补肾活血方抑制氧化应激反应可能与激活Nrf-2/HO-1/NQO1信号通路有关。

凋亡是脊髓继发性损伤过程中神经细胞死亡的主要形式[25]。凋亡过程中，Bcl-2/Bax家族蛋白是不可忽视的关键。Bcl-2能抑制凋亡，而Bax能促进凋亡，二者的比值决定了凋亡的进程[26]。本研究显示，补肾活血方能促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，表明其阻止神经细胞的凋亡可能与改变Bcl-2/Bax蛋白比值有关[27]。

脊髓损伤后星形胶质细胞产生的胶质瘢痕所形成的屏障则是阻止神经细胞再生的关键机制[27,28]。本研究显示，损伤发生后脊髓组织中神经细胞几乎消失，而星形胶质细胞明显活跃；补肾活血方干预后神经细胞增多，而星形胶质细胞的表达降低，这说明补肾活血方可能具有减少胶质瘢痕、恢复神经细胞再生能力的作用，这与组织学结果一致。

综上所述，补肾活血方可能一方面通过Nrf2/HO-1/NQO1通路抑制氧化应激反应，减少神经细胞的凋亡；另一方面通过减轻星形胶质细胞产生的瘢痕，恢复神经细胞再生能力，最终实现治疗脊髓损伤的效果。

参考文献:

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[14]郝红,李方,王志,等隐丹参酮对脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的作用[J].中国临床药理学杂志,2021,37(3):250-254.

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[18]张焱,郝剑,李波,等氧化应激在脊髓损伤中的研究进展[J].中华实验外科杂志,2018,35(6):1184-1189.

基金资助:国家自然科学基金青年项目(82004384); 广东省中医院拔尖人才科研专项资助(BJ2022KY07); 广东省中医药管理局(2021KT1461); 广州市科技计划项目基础研究计划(202102010203);

文章来源:翁家贤,梁超伦,肖方骏等.补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓的修复作用及其机制研究[J].中成药,2023,45(08):2518-2524.