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紫檀茋减轻百草枯诱导的模型大鼠肺纤维化

2023-09-06 168 上传者：管理员

摘要：探究紫檀茋(Pte)减轻百草枯(PQ)诱导大鼠肺纤维化的作用及机制。方法将大鼠随机分为对照(control)组，PQ组(1次性灌胃50 mg/kg百草枯),低、中、高剂量Pte干预组(灌胃PQ 30 min后分别灌胃25、50和100 mg/kg Pte。每天1次，共7 d。)。治疗7 d后，用苏木精-伊红(HE)染色评价肺组织形态，用Masson三色染色评价肺纤维化。ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、IL-6和MIP-2水平。用试剂盒检测肺组织中MDA和SOD含量。Western blot检测肺组织中E-cadherin、α-SMA、vimentin、Nrf2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达。结果与对照组比较，PQ组大鼠肺组织损伤程度，肺纤维化评分，BALF中的IL-1β、IL-6和MIP-2水平，肺组织中MDA含量，α-SMA、vimentin和TGF-β1的蛋白表达水平，NF-κB p65和Smad3蛋白的磷酸化水平均显著升高(P<0.05),而肺组织中SOD含量，E-cadherin和Nrf2的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。Pte干预后，与PQ组比较，Pte组大鼠肺组织损伤程度，肺纤维化评分，BALF中的IL-1β、IL-6和MIP-2水平，肺组织中MDA含量，α-SMA、vimentin和TGF-β1的蛋白表达水平，NF-κB p65和Smad3蛋白的磷酸化水平均显著回降(P<0.05),而肺组织中SOD含量，E-cadherin和Nrf2的蛋白表达水平均显著回升(P<0.05)。结论紫檀茋可能通过激活Nrf2和抑制NF-κB和TGF-β1/Smad2/3信号通路减轻肺部氧化应激和炎性反应，从而抑制纤维化进展。

关键词：
氧化应激
炎性反应
百草枯
紫檀茋
肺纤维化
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肺纤维化是百草枯(paraquat, PQ)中毒最典型的特征之一。核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)途径引起的氧化应激，核因子-κB(nuclear factorκB, NF-κB)途径引起的炎性反应和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad2/3途径引起的纤维化是肺纤维化发生的3个关键途径[1,2,3]。百草枯通过抑制Nrf2信号通路引起肺组织氧化应激[4],通过激活NF-κB信号通路诱导炎性反应[5],通过激活TGF-β1/Smad2/3信号通路引起人肺泡上皮细胞上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[6],最终引起肺纤维化。目前，临床中缺乏有效治疗百草枯中毒和抑制相关肺纤维化进展的药物。紫檀茋(pterostilbene, Pte)是从蓝莓和囊状紫檀中得到的芪类化合物，多项文献报道了紫檀茋的抗肺纤维化作用[7,8]。本研究探索了紫檀茋对百草枯诱导的大鼠肺纤维化的抑制作用，旨在为临床治疗百草枯中毒提供候选药物。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂：

20%百草枯溶液(Syngenta公司);紫檀茋(纯度为99.83%,MedChemExpress公司);苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒和苏木精(北京索莱宝科技有限公司);大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)ELISA试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司);大鼠白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA试剂盒(上海中乔新舟生物科技有限公司);大鼠巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2, MIP-2)ELISA试剂盒(上海富雨生物科技有限公司)。丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒、二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒和高灵敏增强型化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)发光检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);RIPA裂解液和BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所);E-cadherin一抗、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)一抗、vimentin一抗、核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)一抗、NF-κB p65一抗、p-NF-κB p65一抗、TGF-β1一抗、Smad3一抗、p-Smad3一抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗、辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)偶联的IgG二抗(Abcam公司)。

1.1.2动物：

SPF级雄性SD大鼠(7周龄，体质量250～280 g)[陕西师范大学【生产许可证：SCXK(陕)2021-002】]。将大鼠在(23±2)℃、55%±5%湿度、12 h光暗循环照明的环境中饲养，大鼠自由饮食。

1.2方法

1.2.1动物的分组及处理：

将大鼠随机分为对照组(control),百草枯组(PQ组，1次性灌胃50 mg/kg百草枯),低、中、高剂量紫檀茋干预组(L-Pte、M-Pte和H-Pte组，灌胃50 mg/kg百草枯30 min后分别灌胃25、50和100 mg/kg紫檀茋[7,8])。每天给药1次，共给药7 d。

1.2.2肺部组织学染色：

常规制作石蜡切片，使用HE染色评价肺组织形态。使用Masson三色染色评价肺纤维化，根据文献[9]的评分方法进行纤维化评分。

1.2.3 ELISA检测BALF中的细胞因子：

常规收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。将细胞悬液4℃1 500 r/min离心15 min,取上清液。ELISA测定BALF中细胞因子IL-1、IL-6和MIP-2水平。

1.2.4肺组织氧化应激指标的检测：

取肺组织研磨制备匀浆，4℃3 000 r/min离心10 min,取上清液。根据试剂盒说明检测大鼠肺组织中MDA和SOD的水平。

1.2.5免疫组织化学染色检测肺组织TGF-β1和vimentin蛋白表达：

将肺组织切片用3% H2O2消除内源性过氧化物酶，然后在柠檬酸盐缓冲液中微波加热至90℃并维持15 min进行抗原修复。使用含0.025% Triton X-100的TBS溶液洗涤切片2次，然后使用山羊血清在37℃封闭切片30 min。然后在4℃下与1∶500稀释的TGF-β1和vimentin一抗孵育过夜。使用含0.025% Triton X-100的TBS溶液洗涤切片2次，然后与1∶500稀释的HRP偶联的二抗37℃孵育30 min。DAB显色，苏木精复染。使用光学显微镜在400倍放大倍数下拍照。

1.2.6 Western blot检测肺组织E-cadherin、α-SMA、vimentin、Nrf2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达：

RIPA裂解液裂解肺组织，使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质样品经10% SDS-PAGE电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h,然后将膜与E-cadherin(1∶2 000稀释)、α-SMA(1∶2 000稀释)、vimentin(1∶1 000稀释)、Nrf2(1∶1 000稀释)、NF-κB p65(1∶3 000稀释)、p-NF-κB p65(1∶3 000稀释)、TGF-β1(1∶5 000稀释)、Smad3(1∶5 000稀释)、p-Smad3(1∶5 000稀释)和GAPDH(1∶3 000稀释)的一抗4℃过夜孵育。然后与HRP偶联的IgG二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h。使用ECL显影，GAPDH作为内参蛋白。

1.3统计学分析

使用SPSS 22.0软件分析数据，计量资料以均值±标准差(x¯±s)表示，采用单因素方差分析及LSD检验分析组间差异。

2、结果

2.1紫檀茋减轻肺组织损伤和纤维化

PQ组大鼠肺组织出现明显的炎性细胞浸润，伴有肺泡出血、肺泡壁断裂、肺泡间隔水肿、肺泡间隙蛋白质碎屑增多等病变，肺组织纤维化明显。Pte组大鼠病变程度较PQ组减轻，且呈紫檀茋剂量依赖性减轻(P<0.05)(图1)。

2.2紫檀茋降低BALF中的炎性细胞因子水平

与对照组比较，PQ组大鼠BALF中的IL-1β、IL-6和MIP-2水平升高(P<0.05);与PQ组比较，Pte组大鼠BALF中的IL-1β、IL-6和MIP-2水平降低(P<0.05)(表1)。

2.3紫檀茋抑制肺组织氧化应激

与对照组比较，PQ组肺组织中SOD含量降低，MDA含量升高(P<0.05)。与PQ组比较，Pte组肺组织中SOD含量回升，MDA含量回降(P<0.05)(表2)。

2.4紫檀茋抑制了肺组织EMT

PQ组大鼠肺组织中vimentin蛋白高表达，Pte组肺组织中vimentin蛋白表达水平低于PQ组(图2A)。与对照组比较，PQ组肺组织中E-cadherin的蛋白表达水平降低，α-SMA和vimentin的蛋白表达水平升高(P<0.05);与PQ组比较，Pte组肺组织中E-cadherin的蛋白表达水平回升，α-SMA和vimentin的蛋白表达水平回降(P<0.05)(图2B,C)。

2.5紫檀茋激活了肺组织Nrf2信号通路

与对照组比较，PQ组肺组织中Nrf2的蛋白表达水平降低(P<0.05);与PQ组比较，Pte组肺组织中Nrf2的蛋白表达水平回升(P<0.05)(图3)。

2.6紫檀茋抑制了肺组织NF-κB信号通路

与对照组比较，PQ组肺组织中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05);与PQ组比较，Pte组肺组织中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平回降(P<0.05)(图4)。

图1大鼠肺组织HE染色和Masson三色染色结果

表1大鼠BALF中的IL-1β、IL-6和MIP-2水平

PQ group.表2大鼠肺组织中SOD和MDA的含量

2.7紫檀茋抑制了肺组织TGF-β1/Smad2/3信号通路

对照组肺组织中TGF-β1蛋白低表达，PQ组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白高表达，Pte组肺组织中TGF-β1蛋白表达水平低于PQ组(图5A)。与对照组比较，PQ组肺组织中TGF-β1的蛋白表达水平和Smad3蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05);与PQ组比较，Pte组肺组织中TGF-β1的蛋白表达水平和Smad3蛋白的磷酸化水平回降(P<0.05)(图5B,C)。

图2大鼠肺组织中E-cadherin、α-SMA和vimentin的蛋白表达

图3大鼠肺组织中Nrf2的蛋白表达

图4大鼠肺组织中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平

3、讨论

本研究首次探究了紫檀茋对百草枯诱导的肺纤维化的影响，结果表明紫檀茋减轻了百草枯中毒大鼠的肺组织损伤和纤维化，提示紫檀茋可能是一种治疗百草枯中毒的候选药物。氧化应激和炎性反应参与了肺纤维化的病理过程。本研究表明紫檀茋降低了BALF中的炎性细胞因子IL-1β、IL-6和MIP-2的水平，升高了百草枯中毒大鼠肺组织中抗氧化酶SOD含量，降低了氧化产物MDA含量，从而减少了百草枯引起的肺氧化损伤并抑制的炎性反应。

图5大鼠肺组织中TGF-β1的蛋白表达水平和Smad3蛋白的磷酸化水平

EMT参与了百草枯暴露后的肺纤维化形成。EMT过程中，上皮标志物(如E-cadherin)丧失而成纤维细胞标志物(如α-SMA和vimentin)高表达，肺上皮细胞转分化为间质型肌成纤维细胞，进而形成肺纤维化[10]。本研究表明紫檀茋升高了百草枯中毒大鼠肺组织中E-cadherin的蛋白表达水平，降低了α-SMA和vimentin的蛋白表达水平，从而抑制了肺组织EMT。

Nrf2是一种具有抗氧化特性的关键转录因子，Nrf2对纤维化的保护作用已在多项研究中得到证实[11]。本研究表明紫檀茋激活了百草枯中毒大鼠肺组织Nrf2信号通路。据报道，紫檀茋通过激活Keap-1/Nrf2信号通路抑制脂多糖诱导的小鼠肺组织氧化应激，从而减轻肺纤维化[7]。因此，紫檀茋可能通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。

NF-κB信号通路是肺纤维化中重要的炎性反应相关途径。本研究表明紫檀茋抑制了百草枯中毒大鼠肺组织NF-κB信号通路。据报道，紫檀茋通过抑制NF-κB和NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的小鼠肺组织炎性反应，从而减轻肺纤维化[7]。因此，紫檀茋可能通过抑制NF-κB信号通路减轻炎性反应引起的肺损伤。

TGF-β1是主要促纤维化细胞因子，可刺激成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。激活的TGF-β1通过磷酸化Smad2/3调节下游促纤维化基因的转录，如胶原蛋白和α-SMA[12]。EMT通常由TGF-β1介导[13]。本研究表明紫檀茋抑制了百草枯中毒大鼠肺组织TGF-β1/Smad2/3信号通路。据报道，紫檀茋通过抑制TGF-β1/Smads信号通路来抑制果糖诱导的肝纤维化大鼠中的肝细胞EMT[14]。这些结果说明紫檀茋抗百草枯诱导的肺纤维化的作用与TGF-β1/Smad2/3信号通路密切相关。

综上所述，本研究表明紫檀茋在百草枯中毒大鼠中具有良好的抗肺纤维化作用，紫檀茋通过激活Nrf2和抑制NF-κB和TGF-β1/Smad2/3信号通路减轻肺部氧化应激和炎性反应，从而抑制纤维化进展。本研究对于百草枯中毒相关药物研发具有参考价值。

参考文献:

[6]李美崎,邓俊,王宋平苦参碱减轻百草枯诱导的模型小鼠肺纤维化[J]基础医学与临床,2022,9:1385- 1390.

基金资助：陕西省重点研发计划(2018SF-225)；

文章来源:陈新军,王卿语,陈乐等.紫檀茋减轻百草枯诱导的模型大鼠肺纤维化[J].基础医学与临床,2023,43(09):1383-1389.DOI:10.16352