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汉黄芩素调节SIRT1/Nrf2信号通路对子宫内膜异位症大鼠铁死亡的影响

2023-11-02 214 上传者：管理员

摘要：目的探讨汉黄芩素(Wog)对子宫内膜异位症(EM)大鼠铁死亡的影响及其作用机制。方法构建EM大鼠模型，将SD大鼠分为空白组(CT组)、EM模型组(EM组)、Wog低剂量组(Wog L组)、Wog高剂量组(Wog H组)、Wog+沉默调节蛋白1(SIRT1)抑制剂(EX527)组。给药4周后，检测异位病灶体积，ELISA测定血清雌二醇(E2)、孕激素(P)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6的含量，HE染色观察异位内膜组织病理损伤，普鲁士蓝染色检测铁离子聚集情况，铁离子比色法检测Fe2+浓度，Western blot检测SIRT1、核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和铁蛋白轻链(FTL)蛋白表达水平。结果与CT组相比，EM组大鼠异位内膜组织腺体较少，大量炎性细胞浸润和铁离子沉积，异位病灶体积、E2、P、IL-1β、IL-6、Fe2+水平升高，SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平下降(P<0.05);与EM组相比，Wog L、Wog H组异位内膜组织腺体增加，离子沉积少见，异位病灶体积、E2、P、IL-1β、IL-6、Fe2+水平降低，SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平升高(P<0.05);与Wog H组相比，Wog+EX527组大鼠异位内膜组织炎性细胞浸润和铁离子沉积增加，异位病灶体积、E2、P、IL-1β、IL-6、Fe2+水平升高，SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论 Wog可能通过激活SIRT1/Nrf2信号通路抑制EM大鼠铁死亡。

关键词：
子宫内膜异位症
慢性炎症性疾病
汉黄芩素
沉默调节蛋白1/核因子E2相关因子2信号通路
铁死亡
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子宫内膜异位症(endometriosis, EM)是一种慢性炎症性疾病，定义为子宫内膜组织存在于子宫外，导致盆腔疼痛和不孕，已被视为一个公共卫生问题，严重影响女性的生活质量，并造成沉重的经济负担[1]。铁是细胞生存的必需元素，缺铁是许多生殖疾病的已知危险因素。铁死亡是EM的特征之一，细胞通过逆行月经扩散以存活、植入和建立EM病变，导致铁稳态失调，造成局部铁超负荷、炎症反应等病理生理学变化[2]。温经汤是一种传统中药，已被证明对EM有治疗作用，网络药理学分析结果指出，汉黄芩是温经汤的活性成分之一，可能通过调节炎症、内分泌治疗EM,且Wog本身得抗炎、抗病毒感染活性极强，对大多数炎症类疾病都有效果[3]。沉默调节蛋白1(silent information regulator 1, SIRT1)是一种应激反应蛋白，在不同的细胞和生理功能中发挥着关键作用，如线粒体生物发生、细胞损伤和细胞死亡(包括铁死亡)等，SIRT1脱乙酰化激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2, Nrf2)能够抑制铁死亡进程[4]。Wog能否通过调节SIRT1/Nrf2信号通路抑制EM铁死亡暂不清楚，本研究旨在借助EM动物模型探究Wog对EM的影响和SIRT1/Nrf2轴的调控作用，尝试为开发EM的治疗药物提供一定理论基础。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

8周龄健康未孕SD雌性大鼠，体重206～235 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，生产许可证号：SCXK(沪)2022-0007。动物实验环境为SPF级动物房，12 h/12 h光暗循环，温度(24±1)℃,湿度(50±10)%。

1.1.2药物、主要试剂

Wog(纯度≥98%,632-85-9),购自上海吉至生化科技有限公司；SIRT1抑制剂(EX527,HY-15452),购自美国MCE公司；白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β,CB10205-Ra)、IL-6(CB10218-Ra)ELISA试剂盒，购自上海科艾博生物技术有限公司；雌二醇(estradiol, E2,J22765)、孕激素(progestin, P,J22752)ELISA试剂盒，购自吉利德生物；一抗SIRT1(ab110304)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4, GPX4,ab125066)、溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7, SLC7A11,ab307601)和铁蛋白轻链(ferritin light chain, FTL,ab75973),购自美国Abcam公司；一抗Nrf2(80593-1-RR),购自武汉三鹰。

1.2方法

1.2.1动物造模及给药

大鼠适应性喂养1周，连续3 d灌胃戊酸雌二醇0.1 mg/(kg·d)使大鼠处于同一动情周期，采用自体子宫移植法构建EM大鼠模型。大鼠禁食24 h,麻醉，开腹，结扎左侧子宫并切除子宫角，纵向切开子宫组织，剪为5 mm×5 mm的组织块，迅速将组织块固定至右侧腹壁血管丰富部位，缝合切口；术后3 d每只腹腔注射庆大霉素(0.4×104U/d)预防感染，自术后第2天开始灌胃戊酸雌二醇(0.1 mg/kg, 2次/周)促进子宫内膜移植；4周后再次开腹，移植物体积增大且形成含淡黄色透明液体的囊状结构，异位病灶充血，新生血管丰富，表示造模成功[5]。

将所有大鼠随机分为5组：空白组(CT组)、EM模型组(EM组)、Wog低剂量组(Wog L组)、Wog高剂量组(Wog H组)、Wog+EX527组，每组12只。CT组以外所有大鼠建立EM模型，CT组大鼠仅行单侧子宫切除，不做异位移植。造模成功后第2天做给药处理，Wog根据参考文献[6,7]并做适量调整，Wog L组、Wog H组大鼠灌胃给药7、14 mg/(kg.d)Wog+腹腔注射2 mL/kg/d 0.9%氯化钠溶液；将EX527(10 mg/kg)溶解于1%二甲亚砜、30%聚乙二醇和0.9%氯化钠溶液中，Wog+EX527组大鼠灌胃给药14 mg/(kg.d) Wog+腹腔注射2 mL/(kg.d) EX527溶液；CT组和EM组大鼠灌胃+腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。给药持续4周，给药过程中损失大鼠及时补充。

1.2.2异位病灶体积测定

给药结束后，所有大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠完全麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血5 mL静置30 min,离心后取上层血清，分装储存；随后收集完整的异位内膜组织，使用游标卡尺迅速测量其长、宽、高，样品分为2份，分别保存在4%多聚甲醛溶液中和-80℃冰箱中。异位病灶体积(mm3)=0.52×长×宽×高。

1.2.3血清性激素和促炎细胞因子含量测定

取1.2.2中血清样本，依照ELISA检测试剂盒说明书测定检测E2、P、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.4异位内膜组织病理学观察

将1.2.2保存在多聚甲醛中的异位内膜组织进行乙醇脱水、包埋和切片处理，切片去石蜡、干燥，按照试剂盒说明书进行HE染色，光学显微镜下拍照并分析异位内膜组织病理学变化。

1.2.5异位内膜组织铁离子聚集情况检测

将1.2.4中石蜡切片脱蜡，亚铁青化钾溶液和盐酸溶液等比例混合成普鲁士蓝染液染色切片1 h,核固红染液染色5 min,切片依次放入无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min透明，中性树胶封片，显微镜拍照，铁呈蓝色，细胞核呈红色。

1.2.6异位内膜组织Fe2+浓度检测

取1.2.2中冷藏的异位内膜组织，匀浆，样本分为2份，其中1份按照铁离子比色法检测试剂盒说明书检测Fe2+的浓度，另1份储存于-80℃冰箱待测。

1.2.7异位内膜组织SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达检测

定量1.2.6中匀浆样品总蛋白浓度，采用Western blot法检测蛋白的表达。配制SDS-PAGE凝胶，样品上样10μg,电泳设置为80 V通电30 min后转为120 V通电1 h,转膜仪设置为200 V,随后封闭PVDF膜，目的条带置于抗体稀释液中过夜，再经过二抗稀释液和ECL化学发光液孵育，拍照并分析蛋白表达水平。

1.3统计学分析

所有数据符合正态分布并以均值±标准差

表示，使用GraphPad Prism 8.0.2分析，多组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠异位病灶体积比较

与CT组比较，EM组大鼠异位病灶体积增大(P<0.05);与EM组比较，Wog L、Wog H组大鼠异位病灶体积呈剂量依赖性减小(P<0.05);与Wog H组比较，Wog+EX527组大鼠异位病灶体积增大(P<0.05,图1A)。

2.2各组大鼠血清性激素和促炎细胞因子含量比较

与CT组比较，EM组E2、P、IL-1β、IL-6含量升高(P<0.05);与EM组比较，Wog L、Wog H组E2、P、IL-1β、IL-6含量呈剂量依赖性降低(P<0.05);与Wog H组比较，Wog+EX527组E2、P、IL-1β、IL-6含量升高(P<0.05,图1B)。

图1异位病灶体积、血清性激素和促炎细胞因子含量比较

2.3各组大鼠异位内膜组织病理学变化

HE染色结果显示，CT组子宫内膜组织结构完整，腺体排列整齐；EM组腺体较少，可见大量炎性细胞浸润；与EM组比较，Wog L、Wog H组腺体增多，炎性细胞浸润减少，病理损伤减轻；与Wog H组比较，Wog+EX527组组织损伤严重，炎性细胞浸润增加(图2)。

图2各组大鼠异位内膜组织HE染色结果

2.4各组大鼠异位内膜组织铁离子聚集情况

CT组子宫内膜组织未见明显蓝色染色颗粒；EM组可见大量明显蓝色染色颗粒，铁沉积量高；与EM组比较，Wog L、Wog H组蓝色染色颗粒明显减少，铁沉积量显著降低；与Wog H组比较，Wog+EX527组蓝色染色颗粒增多(图3)。

图3各组大鼠异位内膜组织普鲁士蓝染色结果

2.5各组大鼠异位内膜组织Fe2+浓度比较

与CT组比较，EM组Fe2+浓度显著升高(P<0.05);与EM组比较，Wog L、Wog H组Fe2+浓度呈剂量依赖性降低(P<0.05);与Wog H组比较，Wog+EX527组Fe2+浓度显著升高(P<0.05,图4A)。

2.6各组大鼠异位内膜组织SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平比较

与CT组比较，EM组SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平降低(P<0.05);与EM组比较，Wog L、Wog H组SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平呈剂量依赖性升高(P<0.05);与Wog H组比较，Wog+EX527组SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平降低(P<0.05,图4B、C)。

图4各组大鼠异位内膜组织Fe2+浓度及蛋白表达水平比较

3、讨论

约50%的不孕症妇女发生EM,表现为卵泡发育不良和卵母细胞质量下降，铁死亡是造成卵母细胞成熟障碍的主要原因[8]。子宫内膜基质细胞铁死亡还可能触发细胞因子分泌，并通过副分泌作用促进邻近病变血管的生成，从而推动EM的发展[9],探寻改善EM铁死亡的靶向制剂刻不容缓。Wog是黄酮类化合物的成员之一，来源于唇形科植物黄芩、滇黄芩、半枝莲等根茎，具有抗癌、抗炎、抗焦虑、神经保护、治疗细菌和病毒感染等多种活性[10]。EM是一种慢性炎症性疾病，本研究主要探究Wog对EM铁死亡的影响及可能的作用机制。

本研究采用自体子宫移植法构建EM大鼠模型，模型大鼠异位病灶体积增大，异位内膜组织腺体较少，可见大量炎性细胞浸润，呈典型的EM病理状态，说明模型构建成功。血清E2、P是反映性激素水平的2个重要指标，临床数据显示，EM患者血清E2、P水平较健康人群显著升高[11]。IL-1β、IL-6是引起慢性炎症所必需的细胞因子，影响子宫内膜基质细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭，在EM的发生发展中发挥促进作用[12]。本研究也发现，EM大鼠血清E2、P、IL-1β、IL-6含量升高，说明性激素紊乱和炎症因子的过表达可能是促进EM进展的2个因素。EM大鼠经过Wog治疗显著抑制病灶体积的增大，改善异位内膜组织病理损伤，降低血清E2、P、IL-1β、IL-6的含量，说明Wog对EM具有治疗效果。

铁死亡是一种新型细胞程序性死亡形式，不同于细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬等传统细胞死亡形式，其特征在于脂质过氧化物的铁依赖性积累至致死量，引起器官损伤和退行性病理[13]。铁是包括人类在内的大多数生物体生存的必需元素，铁摄入过多、高铁状态、铁死亡与包括EM在内的生殖疾病有关[14]。SIRT1可以调控细胞氧化应激、炎症反应、线粒体功能、自噬、凋亡等多种生理过程[15]。Nrf2是细胞抗氧化反应的关键调节因子，抵消氧化和亲电应激基因的表达[16]。SIRT1脱乙酰化激活Nrf2能够抑制铁死亡进程。GPX4是能够直接还原复杂磷脂氢过氧化物的酶，也是Nrf2的下游靶基因，靶向抑制GPX4被认为是触发铁死亡的关键策略[17]。SLC7A11和FTL是调节铁死亡的关键蛋白，抑制SLC7A11和FTL活性、下调GPX4可以诱导铁死亡[18]。铁死亡细胞及其溢出内容物还与疾病中的免疫反应失调有关[19]。本研究发现，EM大鼠异位内膜组织大量铁沉积，Fe2+浓度显著升高，SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平降低，说明EM触发了铁死亡，机体处于高铁状态，SIRT1/Nrf2信号通路被抑制，这可能也与前述促炎细胞因子过表达有关；Wog不仅能缓解铁沉积和Fe2+浓度升高，还能增加SIRT1、Nrf2、GPX4、FTL和SLC7A11蛋白表达水平；SIRT1抑制剂EX527和Wog联合使用干预EM大鼠的治疗效果和对SIRT1/Nrf2轴的影响不明显，未改善铁死亡现象，提示Wog可能通过激活SIRT1/Nrf2信号通路抑制EM大鼠铁死亡。

综上所述，Wog可能通过激活SIRT1/Nrf2信号通路抑制EM大鼠铁死亡。除此以外，Wog抑制肿瘤细胞ZR-75-30和HeLa的增殖以及治疗类风湿性关节炎也与调控铁死亡有关[20,21]。SIRT1/Nrf2途径对机体代谢的调控也是多方面的，本研究仅分析了SIRT1/Nrf2通路在调节EM铁死亡的作用，之后可以做进一步研究，丰富Wog作为临床用药的理论依据。

参考文献:

[20]郑,贺超,姜钰婷,等基于网络药理学和实验验证探讨黄调控铁死亡逆转肿瘤耐药的作用机制[J].现代药物与临床,2023,38(3):519-530.

[21]肖剑伟,蔡旭,郭粉莲,等基于权基因共表达网络及分子动力学探讨二妙散影响铁死亡治疗类风湿关节炎的机制[J].中医学报,2022,37(1):2418-2425

基金资助:上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设项目(NO:PWZxq2022-15);

文章来源:胡晓英,吴建发,王鹰等.汉黄芩素调节SIRT1/Nrf2信号通路对子宫内膜异位症大鼠铁死亡的影响[J].遵义医科大学学报,2023,46(10):943-949.